المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحليل تدفق cytometric.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل خلايا الدماغ والحبل الشوكي وحيدات النوى Percoll باستخدام التدرجات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مطلوب في كثير من الأحيان عزل الخلايا المناعية التي التسلل الى الجهاز العصبي المركزي (CNS) خلال والعدوى المناعة الذاتية ، والصدمات النفسية أو تنكس عصبي ، لتحديد النمط الظاهري ووظائفها المستجيب. النهج النسيجية هي مفيدة لتحديد موقع الخلايا والتسلل لتحليل الجهاز العصبي المركزي المرتبطة الأمراض. ومع ذلك ، محدودة في الموضع الكيمياء النسيجية وتقنيات التلوين مناعي من قبل عدد من الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها في وقت واحد لتميز فرعية الخلايا المناعية في نسيج معين. ولذلك ، والنهج النسيجية بالتعاون مع phenotyping المناعة بواسطة التدفق الخلوي حاسمة لتوصيف كامل لتكوين تسلل CNS المحلية. ويستند هذا البروتوكول على الفصل بين الجهاز العصبي المركزي التعليق على مدى الخلوية التدرجات percoll discontinous. المقالة الحالية يصف بروتوكول السريع لعزل خلايا وحيدات النوى بكفاءة من أنسجة الحبل الشوكي والدماغ التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد مختلف السكان الخلايا المناعية في عينة واحدة بواسطة التدفق الخلوي.
البروتوكول
إعداد الكواشف
إعداد المخزون متساوي التوتر percoll (SIP) ، و 4 مل في المخ ، عن طريق خلط 9 أجزاء من percoll مع جزء واحد من دون HBSS 10X الكالسيوم والمغنيسيوم + + + +.
إعداد المسبار في 70 ٪ في 1X HBSS دون الكالسيوم والمغنيسيوم + + + + ، 2 مل في الدماغ الاستغناء في أنبوب 15 مل المخروطية البولي بروبلين.
ملاحظة : من المستحسن أن تستخدم percoll في درجة حرارة الغرفة ، إذا ما استخدمت الباردة ، وتميل إلى الخلايا تتجمع وفصل الخلية هو أقل ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد استخدمت تحليلات علامات سطح الخلية في الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض من الأنسجة الملتهبة والفأر العادي لعدة عقود 1-3. وتستند بروتوكولات العزل في فصل الخلايا الدبقية الصغيرة والكريات البيض بنسبة 4 الطرد المركزي الكثافة. نحن هنا وصف طريقة سريعة وفعالة لعزل الجهاز العصبي المركزي الكريات البيض باستخدام التدرجات percoll متقطع. بعد عزل الخلايا ، وتلطيخ مع أضداد مختلفة مثل ، ولكن ليس على سبيل الحصر ، CD45 ، CD4 ، CD8 ، CD11b ، CD19 ، وما إلى ذلك يسمح بتحديد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل الجمعية الوطنية لمرض التصلب العصبي المتعدد (TA 3021 - A1 / T لAEC) وجامعة تكساس في سان انطونيو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
تجانس الأنسجة والتدرجات
- Percoll (أمرشام)
- هانكس 10X "محلول الملح المتوازن ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم (Gibco)
- RPMI متوسطة 1640 ، دون أحمر الفينول (Gibco)
- 7 مل أو 15 مل Dounce المطاحن الأنسجة (VWR)
التدفق الخلوي
- خلية يلطخ العازلة (Biolegend)
- منقى لمكافحة فأر CD16/CD32 ماوس (الفأرة دينار بحريني التيسير بلوك) ، BD Pharmingen
- عدادة الكريات (فيشر)
- مكافحة فأر CD45 (استنساخ 30 - F11) ، CD4 (استنساخ RM4 - 5) ، CD19 (استنساخ 6D5) ، BioLegend
- التخزين المؤقت الفوسفات 10X المالحة ، دون الكالسيوم والمغنيسيوم (الحرارية العلمية)
- بارافورمالدهيد (سيغما الدريتش)
- تحليل التدفق الخلوي يؤديها مع الثاني LSR دينار بحريني (العلوم البيولوجية)
المراجع
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
