ويمكن استخدام [أليغنوكليوتيد] إلى موقع بديل على وجه التحديد النوكليوتيدات واحد من الجينات المستهدفة في كل من transfected الأنوفيلة الغامبية و الأنوفيلة stephensi الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ترنسفكأيشن والطفرات في الجينات المستهدفة في الخلايا عن طريق البعوض مغلق [أليغنوكليوتيد] حمض تعديل الأحماض النووية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتنتقل الطفيليات المتصورة ، العامل المسبب للمرض الملاريا ، عن طريق لدغات البعوض المصابة الأنوفيلة الناتجة في أكثر من 250 مليون إصابة جديدة سنويا. رغم عقود من البحث ، وأنه لا يوجد لقاح ضد الملاريا ، وتسليط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات مكافحة الرواية. نهج واحد هو استخدام مبتكرة من البعوض المعدل وراثيا لمكافحة الملاريا بفعالية انتقال الطفيلي. تم العثور على التعديلات المتعمدة من مسارات إشارات الخلية في البعوض عن طريق الطفرات المستهدفة ، لتنظيم الطفيلي التنمية 1. من هذه الدراسات ، ويمكننا أن نبدأ في تحديد الأهداف المحتملة للتحول الجينات. وقد اعتمد الطفرات المستهدفة تقليديا على إعادة التركيب مثلي بين الجينات المستهدفة وجزيء DNA كبيرة. ومع ذلك ، وبناء واستخدام مثل هذه جزيئات الحمض النووي لتوليد معقدة من خطوط الخلايا تحولت ستابلي غير مكلفة ، وتستغرق وقتا طويلا وغير فعالة في كثير من الأحيان. ولذلك ، ووضع استراتيجية استخدام حمض النووي مؤمن المعدلة [أليغنوكليوتيد] (LNA فيرفكس) يوفر بديلا مفيدا لإدخال بدائل اصطناعية النوكليوتيدات واحد في episomal والكروموسومات الجينات أهداف الحمض النووي (التي استعرضت في 2). وقد استخدمت LNA - ON بوساطة الطفرات التي تستهدف إدخال طفرات الجينات في نقطة من الفائدة في خلايا الخميرة المثقف على حد سواء والفئران 3،4. نعرض هنا التي يمكن استخدامها LNA الإضافات إلى إدخال تغيير واحد في النوكليوتيدات استهداف episomal transfected أن النتائج في التحول من اللون الأزرق الفلورسنت التعبير (BFP) البروتينات الفلورية الخضراء إلى التعبير (GFP) البروتين في الأنوفيلة الغامبية على حد سواء والخلايا الأنوفيلة stephensi . يوضح هذا التحويل للمرة الأولى التي يمكن أن تكون الطفرات بوساطة فعالة من الجينات المستهدفة في الخلايا بواسطة البعوض LNA الإضافات ويشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن تنطبق على الطفرات الكروموسومية من الأهداف في المختبر والمجراة.
البروتوكول
- قبل البدء في البروتوكول ، من المهم أن تقرر أن البعوض الخلايا التي استخدمت في التجربة ويتمتعون بصحة جيدة عند التقاء ~ 80 ٪ إذا كان ملتصق (الشكل 1) والخلايا متضخمة أو غير صحية نتيجة انخفاض في كفاءة ترنسفكأيشن وسوف تعطي نتائج غير متناسقة.
- الاحماء قبل جميع وسائل الإعلام ، لاستخدامها في حمام الماء ° 28 مئوية لمدة 30 دقيقة.
- ألف stephensi MSQ43 تتطلب الخلايا E5 المتوسط : MEM ، ث ايرل ل/ الجلوتامين ، و 5 ٪ FCS الحرارة المعطل ، 0.2 ٪ D - غلوكوز ، 1 ٪ للمضادات الحيوية البنسلين الستربتوميسين ، و 1 ٪ غير الأحماض الأمينية الأساسية.
- ألف الغامبية SUA5B تتطلب الخلايا المتوسطة S2 : شنايدر ذبابة الفاكهة المتوسطة ، و 5 ٪ FCS الحرارة المعطل ، و 1 ٪ البنسلين ، المضاد الحيوي الستربتوميسين
- ذوبان الجليد وتخزين جميع المواد كاشف ترنسفكأيشن ، البلازميدات و[أليغنوكليوتيد] على الجليد.
- وينبغي تنفيذ كل الإجراءات في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية معقمة.
- لخلايا ملتصقة (A. الغامبية SUA5B ، A. stephensi MSQ43) نضح قبالة سائل الإعلام القديمة من دون إزعاج الخلايا ، إضافة وحدة تخزين ما يعادل من وسائل الإعلام الجديدة التي تم تحسنت إلى 28 درجة مئوية ، ثم شطف قبالة والخلايا من أسفل القارورة باستخدام ماصة.
- وينبغي تحديد تركيز الخلايا وتعديلها لتركيز النهائي من الخلايا 1x10 6 / مليلتر. يمكن أن تظل الخلايا في درجة حرارة الغرفة في حين تستعد المواد كاشف ترنسفكأيشن.
- إضافة 1 مل من الخلايا البعوض (1x10 6 خلية / مل) إلى كل جانب من لوحة 6 - جيدا. إعداد طبق من ذهب لكل شرط التجريبية (أنظر أدناه).
الجدول الأول هو مخطط pipetting عن ترنسفكأيشن العامة. الجدول الثاني يبين خمسة شروط لاختبار الطفرات الناجح لالنوكليوتيدات واحد باستخدام BFP محددة LNA الإضافية. في الأولين ، وpGFP pBFP ، والضوابط الإيجابية والسلبية ، على التوالي. ما تبقى من الشروط التجريبية pBFPs مع زيادة تركيزات BFP محددة LNA الإضافية. في الخطوات من 8 إلى 12 ، إضافة كميات مناسبة من كاشف وفقا لكل حالة. - نقل الحمض النووي البلازميد إلى 1.5 مل العقيمة أنبوب microcentrifuge وإضافة حجم مناسب لالعازلة المفوضية الأوروبية.
- لDNA البلازميد 1 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) ، تضاف 99 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- : 1 pGFP ميكرولتر (1μg / ميكرولتر) ، تضاف 99 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- : 1 pBFP ميكرولتر (1μg / ميكرولتر) ، تضاف 99 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- : 1 pBFP ميكرولتر (1μg / ميكرولتر) و 1 ميكرولتر ON (ميكروغرام / ميكرولتر) ، تضاف 98 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- : 1 pBFP ميكرولتر (1μg / ميكرولتر) و 5 ميكرولتر ON (1μg / ميكرولتر) ، تضاف 94 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- : 1 pBFP ميكرولتر (1μg / ميكرولتر) و 10 ميكرولتر ON (1μg / ميكرولتر) ، تضاف 89 ميكرولتر من المفوضية الأوروبية العازلة.
- ثم تضيف ببطء محسن في 1 ميكروغرام من الحمض النووي المستخدمة.
- لDNA البلازميد 1 ميكرولتر ، إضافة 8 محسن ميكرولتر.
- : 1 pGFP ميكرولتر ، إضافة 8 محسن ميكرولتر.
- : 1 pBFP ميكرولتر ، إضافة 8 محسن ميكرولتر.
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 1 ON ، إضافة محسن 16 ميكرولتر.
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 5 ON ، إضافة محسن 48 ميكرولتر.
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 10 ON ، إضافة محسن 88 ميكرولتر.
- دوامة DNA / العازلة / محسن الخليط لمدة 1 ثانية وتأكد من أن جميع من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب. احتضان ثم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- إضافة كاشف Effectene في DNA البلازميد 1 ميكروغرام ودوامة لمدة 10 ثانية. تأكد من أن جميع من الحل هو في الجزء السفلي من الأنبوب ثم يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- لDNA البلازميد 1 ميكرولتر ، إضافة Effectene 10 ميكرولتر (الجدول الأول).
- : 1 pGFP ميكرولتر ، إضافة Effectene 10 ميكرولتر (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر ، إضافة Effectene 10 ميكرولتر (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 1 ON ، إضافة Effectene 20 ميكرولتر (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 5 ON ، إضافة Effectene 60 ميكرولتر (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 10 ON ، إضافة 110 Effectene ميكرولتر (الجدول الثاني).
- جلب كل أنبوب إلى الحجم النهائي من 1000 ميكرولتر تحسنت وسائل الإعلام عن طريق إضافة قطرة قطرة إلى الخليط DNA / العازلة / محسن / Effectene. الحمض النووي قد يعجل في هذه المرحلة إذا تم إضافة وسائل الاعلام بسرعة كبيرة جدا. المزيج بلطف صعودا ونزولا pipetting 3-4 مرات.
- لDNA البلازميد 1 ميكرولتر ، إضافة الوسائط 882 ميكرولتر (الجدول الأول).
- : 1 pGFP ميكرولتر ، إضافة الوسائط ميكرولتر 882 (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر ، إضافة الوسائط ميكرولتر 882 (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 1 ON ، إضافة 864 ميكرولتر وسائل الاعلام (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر وميكرولتر 5 ON ، إضافة 792 ميكرولتر وسائل الاعلام (الجدول الثاني).
- : 1 pBFP ميكرولتر و10 ميكرولتر ON ، إضافة الوسائط 702 ميكرولتر (الجدول الثاني).
- إضافة القادم ببطء 1 مل من مزيج الحمض النووي / محسن / Effectene المناسبة لكل قطرة جيدا في كل مرة.
- دوامة لوحة بلطف لضمان التوزيع الموحد للخلايا وخليط ترنسفكأيشن. Incubatه الخلايا في ظل ظروف النمو الطبيعي.
- بعد يوم واحد ترنسفكأيشن ، نضح برفق خارج وسائل الإعلام واستبدالها ببطء مع حجم ما يعادلها من وسائل الإعلام تحسنت حديثا. من المهم أن لا يزعج طبقات الخلايا في الجزء السفلي من الآبار عند القيام بذلك.
- بعد يومين من دراسة الخلايا ترنسفكأيشن مراقبة إيجابية مع transfected pGFP الفلورية تحت المجهر لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن (الشكل 2).
- SUA5B الخلايا تنمو بسرعة كبيرة ، وسوف تصبح متضخمة. بعد أربعة أيام من هذه الخلايا بواسطة الشفط ترنسفكأيشن رقيقة من وسائل الإعلام القديمة وإضافة وحدة تخزين ما يعادل ببطء من وسائل الإعلام تحسنت حديثا.
- بعد إضافة وسائل الإعلام الجديدة للآبار ، فصل جميع الخلايا من الجزء السفلي من كل بئر بواسطة pipeting صعودا وهبوطا ، تجاهل نصف حجم (1 مل) من خليط الخلايا وإضافة 1 مل من جديد وسائل الإعلام لجلب الدفء الحجم النهائي إلى 2 مل.
- فحص خلايا يوميا للتأكد من أنهم يتمتعون بصحة جيدة وغير متضخمة ، رقيقة عند الضرورة.
- السماح للخلايا أن تنمو في ظل الظروف العادية ل5-7 ترنسفكأيشن آخر قبل أيام من جمعها لتحليلها.
- في 5-7 ترنسفكأيشن آخر أيام ، جمع الخلايا بواسطة الشفط خارج وسائل الإعلام القديمة في جميع الآبار وإضافة 1 مل من غرفة معقمة PBS درجة الحرارة إلى كل بئر.
- فصل الخلايا من أسفل جيدا pipetting صعودا وهبوطا ونقل خليط الخلية إلى 5 مل من أنابيب غطاء المفاجئة ويحلل على الفور عن طريق خلايا التدفق الخلوي.
ممثل النتائج
الشكل 1. ألف صحية Untransfected stephensi MSQ43 (A) و أ. الغامبية SUA5B (B) في خلايا حوالي 80 ٪ التقاء.
الشكل 2 ألف. stephensi MSQ43 (A) و أ. الغامبية SUA5B (B) مع خلايا transfected GFP ايجابية معربا عن السيطرة البلازميد.
الشكل 3. بيانات التدفق الخلوي مؤكدا تحويل BFP لGFP طريق الطفرات واحد من ترنسفكأيشن التالية النوكليوتيدات مع BFP محددة مؤمنة [أليغنوكليوتيد] حمض النووي المحورة (LNA فيرفكس). وكانت الخلايا transfected SUA5B مع GFP معربا عن البلازميد (pGFP) ومراقبة إيجابية ، مع الإعراب عن BFP البلازميد (pBFP) كعنصر تحكم السلبية ، أو مع pBFP وزيادة تركيزات BFP محددة LNA الإضافية. (أ) استراتيجية المحاصرة للبيانات التدفق الخلوي تظهر من اليسار إلى اليمين : مبعثر إلى الأمام في مقابل الجانب من الخلايا الحية ، propidium يوديد (PI) الخلايا السلبية والإيجابية الخلايا GFP خمسة أيام التالية ترنسفكأيشن. (ب) رسم بياني لنسبة خلايا GFP الإيجابية المبينة في (أ) ترنسفكأيشن التالية مع pBFP وزيادة تركيزات LNA الإضافية.
شروط الجدول أولا ترنسفكأيشن.
الجدول الثاني. ترنسفكأيشن الظروف المستخدمة في الشكل 1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نحن هنا في طريقة تقديم الأدلة والمختبر لتحويل المستهدفة من النوكليوتيدات واحد في الهدف الجين episomal التالية ترنسفكأيشن من LNA الإضافات إلى A. وألف stephensi خلايا الغامبية. LNA - ON بوساطة التحويل الجيني يتطلب استحثاث موقع محدد الحمض النووي ردا الإصلاح ؛ البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن الخلايا البعوض يمكن أن تدعم هذه الآلية لمواقع محددة الطفرات. بينما يستند الطريقة المعروضة هنا على تحويل هدف episomal ، البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن ي...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر آبي سبينر في المركز الوطني للبحوث الرئيسيات في كاليفورنيا للحصول على المساعدة لها مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة بتمويل من المعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة الوطنية (NIH) AI073745 ، AI080799 وAI078183.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كاشف ترانسفكشن Effectene | Qiagen | 301425 | |
| بلازميد GFP الضابط (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| بلازميد BFP (pcDNA5/FRT/TO) | هدية من Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | هدية من Dr. Concordet3 | ||
| MEM، وسط Earle’s مع الجلوتامين | Invitrogen | 11095 | |
| مصل العجل الجنيني (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| وسط Schneider’s Drosophila | Invitrogen | 11730 | |
| أحماض أمينية غير أساسية | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| المضاد الحيوي بنسيلين-ستربتومايسين | Invitrogen | 15140 | |
| أطباق زراعة ذات 6 آبار | Corning | 3516 |
المراجع
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
![ترنسفكأيشن والطفرات في الجينات المستهدفة في الخلايا عن طريق البعوض مغلق [أليغنوكليوتيد] حمض تعديل الأحماض النووية](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F2355.jpg&w=3840&q=75)