تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على جمع العينات وفقا لإرشادات IRB الخاصة بالمعهد.
1. حقن الخلايا المسمى في العضوية في الدماغ
ملاحظة: بالنسبة لهذه الورقة ، تم إنتاج العضيات الدماغية باستخدام مجموعة تجارية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. يمكن استبدال هذا بالعضوية الدماغية ذات الأهمية. يجب تبريد المواد المستخدمة في هذا الجزء من البروتوكول مسبقا لتجنب تبلور مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان عند درجات حرارة أعلى من 4 درجات مئوية.
- ضع حقنة (حقن) الأنسولين والأطراف والأنابيب التي ستكون على اتصال بمصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان عند -20 درجة مئوية للسماح لها بالتبريد.
- قم بإذابة كمية مناسبة الحجم من مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان على الجليد ، اعتمادا على عدد الحقن التي سيتم إجراؤها (~ 2 ميكرولتر / حقن). يستغرق هذا حوالي 30 دقيقة.
- أثناء ذوبان الذوبان ، قم بتقسيم الخلايا وحصادها وعدادها.
- احسب الأحجام المطلوبة لكل حقنة. في حالة إجراء حقن متعددة ، ضع الحجم الكلي للخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل ، وأضف ما يصل إلى 1 مل من DMEM / F12.
ملاحظة: يجب استخدام الحجم الذي يسمح ببعض الحقن الإضافية لحساب الخسائر / أخطاء سحب العينات. - ضع الخلايا في الجليد أثناء تحضير الخطوات التالية.
- بعد الذوبان ، قم بتخفيف مصفوفة الغشاء القاعدي القابلة للذوبان إلى تركيز نهائي قدره 3 مجم / مل في DMEM / F12 المثلج.
- خذ المعلق أحادي الخلية من الجليد ، وقم بتدويره عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: إذا لم يكن جهاز الطرد المركزي المبرد متاحا ، يبدو أن الدوران في درجة حرارة الغرفة مقبول بشكل عام. - قم بإزالة الوسط برفق تماما دون إزعاج حبيبات الخلية. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب العينة اللطيف في مصفوفة الغشاء القاعدي المخففة القابلة للذوبان (3 مجم / مل) للحصول على حجم نهائي قدره 2 ميكرولتر لكل حقنة يتم إجراؤها ، ثم ضعها على الفور مرة أخرى على الجليد حتى الاستخدام.
ملاحظة: يجب إجراء إعادة تعليق الخلايا ببطء وبأطراف مبردة مسبقا لتجنب تكوين الفقاعات والتبلور. - انقل المحاقن (المحاقن) المبردة مسبقا من الفريزر -20 درجة مئوية إلى دلو ثلج. احتفظ بها هناك حتى الاستخدام.
- قم بإزالة اللوحة مع عضيات الدماغ من الحاضنة. استخدم طرفا عريضا لنقل العضو المراد حقنه في طبق 35 مم. قم بإزالة كل الوسائط الممكنة دون الإضرار بالعضوية لتثبيتها وتسهيل الحقن.
ملاحظة: من المهم استخدام أطراف واسعة التجويف لتجنب تدمير العضوية. إذا لم تكن متوفرة ، فقم بقص نهاية طرف P1,000 العادي بمقص معقم. - ضع الطبق مقاس 35 مم الذي يحتوي على العضوي تحت مجهر تشريح للمساعدة في توجيه وتسهيل الحقن.
ملاحظة: إذا لم يكن المجهر التشريح متاحا في منطقة معقمة ، فمن الممكن إجراء الحقن بدون واحد ، وإن كان ذلك مع تحكم منخفض إلى حد ما. بديل آخر هو استخدام حلقة التكبير أو النظارات. - بمجرد أن تصبح العضوية (العضيات) جاهزة للحقن ، أعد تعليق الخلايا برفق بطرف ماصة P20 مبردة ، وحرك 2 ميكرولتر (يحتوي على العدد المطلوب من الخلايا المراد حقنها) على شريحة زجاجية معقمة مسبقة التبريد.
ملاحظة: بالنسبة للحقن المتعددة ، يمكن إضافة حجم إضافي 2 ميكرولتر عبر الشريحة الزجاجية. احتفظ بها على الجليد ، واحرص على تجنب التبخر. - خذ حقنة الأنسولين المبردة مسبقا من الثلج ، وارسم ببطء 2 ميكرولتر من تعليق الخلية مع توجيه شطبة الإبرة لأسفل للسماح بامتصاص جميع الخلايا / الوسط.
ملاحظة: تأكد من السير ببطء شديد لتجنب سحب أي هواء. - افتح غطاء الطبق الذي يحتوي على العضوية ، وركز المجهر عليه. امسك الطبق بيد واحدة. ضع شطبة الإبرة لأعلى ، وباليد الأخرى ، قم بحقن الخلايا ببطء في السطح العضوي.
ملاحظة: من المهم الحقن ببطء لتجنب إتلاف الأنسجة. - بعد الحقن ، ضع الغطاء مرة أخرى في الطبق ، واترك العضوية المحقونة لمدة 1-2 دقيقة
ملاحظة: هذا يسمح لمصفوفة الغشاء القاعدي المخففة والقابلة للذوبان بالهلام ، مما يثبت الخلايا في مكانها. إذا تمت إضافة الوسيط مبكرا جدا ، فيمكنه غسل الخلايا الموجودة على السطح. - أضف برفق 500 ميكرولتر من الوسط العضوي ، وانقل العضوية بطرف عريض إلى بئر من 24 بئرا. احتضان العضوية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها. قم بإجراء تغييرات كاملة في الوسط كل يومين.
ملاحظة: من المهم تضمين جهاز تحكم سلبي (حقن وهمية) ، والذي سيتم استخدامه لتعديلات التصوير. للقيام بذلك ، قم بحقن مادة عضوية كما هو موضح سابقا بمصفوفة غشاء القاعدي المخففة القابلة للذوبان (3 مجم / مل) للحصول على حجم نهائي يبلغ 2 ميكرولتر بدون خلايا.