مقالة منهجية

عزل المستعمرات البكتيرية القائم على الهيدروجيل القابل للتحلل الضوئي في مصفوفات Microwell

أغسطس 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Fattahi, N., et al. واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل الضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو استخدام الهلاميات المائية القابلة للتحلل الضوئي لعزل المستعمرات البكتيرية داخل مصفوفات السيليكون ميكروويل. يتم تحميل الخلايا البكتيرية أولا في الآبار الصغيرة ، وتغليفها في هيدروجيل متشابك ، ويتم زراعتها في مستعمرات متميزة. عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية ، يتيح التحلل المستهدف للهيدروجيل الاستخراج الانتقائي للمستعمرات الفردية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. السلالات البكتيرية وبروتوكولات الاستزراع مستعمرات

  1. البكتيريا على ألواح أجار مكملة بوسائط النمو المناسبة. في هذا التقرير ، يتم استزراع Bacillus subtilis (سلالة 1A1135 ، مركز المخزون الجيني Bacillus) على ATGN (0.079 M KH2PO4 ، 0.015 M (NH4) 2SO4 ، 0.6 mM MgSO4 ·7H2O ، 0.06 mM CaCl2 · 2 H2O ، 0.0071 mM MnSO4 · H2O ، 0.125 م FeSO4 · 7 H2O ، 28 ملي مولار جلوكوز ، درجة الحموضة: 7 ± 0.2 ، 15 جم / لتر أجار) ألواح أجار مكملة ب 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين والإشريكية القولونية (سلالة 25922 ، ATCC) على ألواح أجار ATGN مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
    ملاحظة: التقارير السابقة عن تغليف الهيدروجيل وإطلاقه باستخدام هذه المواد بدلا من ذلك تستخدم خلايا A. tumefaciens C58
  2. اختر المستعمرات المرغوبة من ألواح أجار ATGN وابدأ المزارع بين عشية وضحاها. بالنسبة للإشريكية القولونية و B. subtilis السلالات المستخدمة هنا ، يتم الاستزراع عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 215 دورة في الدقيقة في وسط سائل ATGN لمدة 24 ساعة. قم بتخزين مزارع الخلايا في 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام المستقبلي.
  3. اختر مستعمرات كلتا السلالتين من مخزون الجلسرين باستخدام حلقات تلقيح معقمة واحتضانها في وسائط سائلة ATGN لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 215 دورة في الدقيقة.

2. تحضير المواد اللازمة لتكوين هيدروجيل

  1. تخليق بولي (إيثيلين جلايكول) -o-nitrobenzyl diacrylate (PEG-o-NB-diacrylate) القابل للتحلل الضوئي
    ملاحظة: تم وصف التوليف الداخلي ل PEG-o-NB-diacrylate جيدا وتم الإبلاغ عنه مسبقا. بدلا من ذلك ، نظرا لأن التوليف روتيني ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية من منشأة التخليق الكيميائي.
  2. مخزن مؤقت متشابك
    1. خذ وصفة الوسط المحدد للسلالة البكتيرية وقم بإعداد الوسائط بالعناصر الغذائية 2x. أضف الفوسفات ، على سبيل المثال ، NaH2PO4 ، إلى التركيز النهائي المتوسط إلى 100 مليمتر. ثم اضبط قيمة الأس الهيدروجيني إلى 8 باستخدام 5 M هيدروكسيد الصوديوم (aq).
      2. قم
    2. بتعقيم المحلول العازل وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
      ملاحظة: اترك أي معادن انتقالية موجودة في الوسائط ، لأن هذه المعادن تحفز أكسدة الثيول إلى ثاني كبريتيد.
  3. محلول PEG-o-NB diacrylate
    1. لكل ملغ من مسحوق aliquot PEG-o-NB-diacrylate (الوزن الجزيئي 3،400 Da) ، أضف 3.08 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للوصول إلى تركيز 49 ملي مولار من PEG-o-NB-diacrylate (تركيز 98 ملي مولار).
      2. قم
    2. بتدوير المحلول حتى يمتزج جيدا وقم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.
  4. محلول PEG-thiol ذو 4 أذرع
    1. لتحضير PEG-thiol رباعي الأذرع (10,000 Da الوزن الجزيئي) ، أضف 4 ميكرولتر من الماء عالي النقاء لكل مسحوق ملغ للوصول إلى تركيز 20 ملي مولار (80 ملي مولار من تركيز الثيول).
    2. قم بتدوير هذا المحلول حتى يتم خلطه جيدا وقم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام الآخر.

5. تصنيع مصفوفات السيليكون ميكروويل طلاء

  1. الباريلين: استخدم البروتوكول القياسي الموصوف في المقالات البحثية السابقة لطلاء رقائق السيليكون بالباريلين.
  2. التصنيع المجهر: اتبع البروتوكول الموضح في الأدبيات لتصميم وتصنيع مصفوفة microwell (الشكل 1).
    ملاحظة: تم تطبيق تقنيات الطباعة الحجرية الضوئية القياسية لتصنيع مصفوفات الميكروويات على رقائق السيليكون المطلية بالباريلين.

7. تكوين الهيدروجيل على مصفوفات الميكروويل

  1. بذر البكتيريا في مصفوفات microwell
    ملاحظة: 700 ميكرولتر من 0.1 OD600 (كثافة بصرية بطول موجي 600 نانومتر) تم زرع معلقات الخلايا فوق ركائز مصفوفة microwell ، وتم تطبيق طريقة رفع الباريلين لإزالة الخلايا من الخلفية.
  2. قم بإعداد محلول سلائف الهيدروجيل عن طريق إضافة 5.6 ميكرولتر من PEG-o-NB-diacrylate مع 12.5 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 8 وخلطه مع 6.9 ميكرولتر من محلول PEG thiol رباعي الأذرع.
  3. ماصة 12.5 ميكرولتر من محلول السليفة على شريحة زجاجية مشبعة بالفلور غير متفاعلة ووضع فواصل فولاذية 38 ميكرومتر (انظر جدول المواد) على جانبين متقابلين من ركيزة مصفوفة الآبار الدقيقة الملقحة بالخلايا.
  4. اقلب الشريحة الزجاجية المشبعة بالفلور مع قطرة محلول السليفة وضع القطرة في منتصف ركيزة الميكروويل. ثم احتضن لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) لتكوين هيدروجيل.
  5. قم بإزالة الشريحة الزجاجية برفق من ركيزة microwell. يجب أن يظل غشاء الهيدروجيل متصلا بركيزة الميكروويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة الشكل = 'image image-style-align-center image_resized' style = 'display: table ؛ margin-left: auto ؛ margin-right: auto ؛ width: 75٪ ؛ '>figure-results-1

الشكل 1: تصميم وتصنيع مصفوفات microwell. (أ) تم تطبيق تقنيات التصنيع الدقيق القياسية لتصنيع مصفوفات microwell على رقائق السيليكون. (ب) تتكون كل ركيزة من 7 × 7 مصفوفات بقطر 10 ميكرومتر بعمق ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كبريتات الأمونيومفيشر الكيميائيةA702-500ACS Certified GranularBacillus bacillus subtilis 1A1135Bacillus Genetic StockCenter 1A1135 Brightfield مجهر مستقيمأوليمبوس شركةBX51 كلوريد الكالسيوم ،فيشر كيماوياتلامائية C614-500لكريات المجففات ، 4-20 شبكةDOWSIL 184 قاعدة مطاط سيليكونDow Sillicones Corporation درجة حرارة التخزين: -30-60 درجة مئويةDOWSIL 184 عامل معالجة المطاط الصناعي السيليكونDow Silicones Corporation درجة حرارة التخزين: < 32 درجة مئويةمقياس الطيف الضوئي الدقيق EPOCH2BioTek InstrumentsEPOCH2 الإشريكية القولونية ATCC 25922ثيرمو فيشر العلميR19020 الإيثانول ، اللامائيفيشر الكيميائية459844 فيشرسينت شرائح مجهر ممتاز عاديفيشر ساينتفيك12-544-4 محلول بيروكسيد الهيدروجينيحتوي Sigma-Aldrich216763-500MLعلى مثبط ، 30٪ بالوزن في H2OIsopropanolSigma-Aldrich190764 كبريتات المغنيسيوم ، 7-hydrateMacron Fine Chemicals6066-04Avantor Performance Materials، Inc.كاشف الميثانولسيجما ألدريتش179337-4LACS ، > 99.8٪ نيتروجين ، مضغوطماثيسونUN1066 خماسي ثلاثي الإيثيلين (ميركابتو إيثيل) بولي أوكسي إيثيلين (4 أذرع- PEG) شركة NOF AmericaCorporation PTE-100SHSunbright-PTE-100SHمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، 10XVWR Amresco Life ScienceK813-500MLتخزين بين 15 °C-30 °C شرائح مجهر ممتازفيشر ساينتفيك12-544-425 × 75 × 1 ممكلوريد الصوديومSigma Life ScienceS5886-500Gكاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلاياهيدروكسيد الصوديومSigma-AldrichS8045-500GBioXtra ، > 98٪ ، كريات (لامائية) فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ثنائي الهيدراتسيجما ألدريتش71505-250GBioUltra ، للبيولوجيا الجزيئية ، > 99.0٪ (T) مقياس سمك الفولاذ المقاوم للصدأمنتجات العلامة التجارية الدقيقة77739

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة