$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. الكواشف العامة وتحضير الوسائط لاستخراج الغشاء
- وسائط نمو البكتيريا: قم بإعداد وتعقيم 1 لتر من وسائط المرق في قارورة 2 لتر نظيفة جيدا ومعقمة جيدا.
- المخزن المؤقت لإعادة التعليق العام (1 M tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris Buffer) درجة الحموضة 7.5 ؛ 50 مل): قم بإذابة 6.05 جم من قاعدة Tris في 30 مل من H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.5 مع 5 M HCl. اضبط الحجم النهائي إلى 50 مل باستخدام H2O فائق النقاء.
- مخزون رئيسي من محلول الاستخلاب الكاتيوني ثنائي التكافؤ (0.5 M حمض إيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك ، EDTA درجة الحموضة 8 ؛ 100 مل): أضف 18.6 جم من رباعي أسيتات إيثيلين ثنائي الصوديوم · 2 ساعة2O إلى 80 مل من H2O. يقلب بقوة ويضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH). اضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام H2O.
فائق النقاء: لن يذوب ملح ثنائي الصوديوم في EDTA حتى يتم ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى ~ 8.0 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم. - المخزن المؤقت التناضحي أ (0.5 متر سكروز ، 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 ؛ 1 لتر): تزن 171.15 جم من السكروز وانقله إلى أسطوانة سعة 1 لتر. أضف 10 مل من 1 م تريس درجة الحموضة 7.5. اضبط على مستوى صوت نهائي يبلغ 1 لتر مع H2O فائق النقاء.
- الليزوزيم (10 مجم / مل ؛ 5 مل): يزن 50 مجم من الليزوزيم (بياض بيض الدجاج) ويذوب في 5 مل عالي النقاء H2O. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- محلول الاستخلاب الكاتيوني ثنائي التكافؤ المخفف (1.5 ملي EDTA ؛ 500 مل): أضف 1.5 مل من 0.5 M EDTA (الخطوة 1.3) إلى 497.5 مل H2O فائق النقاء ، يحفظ عند 4 درجات مئوية.
- المخزن المؤقت التناضحي B (0.2 م سكروز ، 10 ملي تريس درجة الحموضة 7.5 ؛ 2 لتر): تزن 136.8 جم من السكروز وانقله إلى أسطوانة سعة 2 لتر. أضف 20 مل من 1 م تريس درجة الحموضة 7.5. اضبط مستوى الصوت النهائي على 2 لتر باستخدام H2O فائق النقاء ، يحفظ عند 4 درجات مئوية.
- العامل المساعد للنوكليز (1 م كلوريد المغنيسيوم ، MgCl2 ؛ 10 مل): قم بإذابة 2.03 جم من MgCl2 · 6 H2O في 8 مل من H2O فائق النقاء ، اضبط الحجم على 10 مل. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- كوكتيل محلول النوكليز بما في ذلك إنزيمات RNase و DNase: انظر جدول المواد. يحفظ في -20 درجة مئوية.
- كوكتيل مثبط للبروتين: انظر جدول المواد. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- محلول تدرج السكروز الأيزوبيكني منخفض الكثافة (20٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي محمويض ثلاثي الرقم الهيدروجيني 7.5 محلول ؛ 100 مل): يزن 20 جم من السكروز وينقل إلى أسطوانة سعة 200 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer الرقم الهيدروجيني 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. اضبط مستوى الصوت النهائي على 100 مل باستخدام H2O فائق النقاء ، احفظه في درجة حرارة الغرفة.
- محلول تدرج السكروز الأيزوبيكني متوسط الكثافة (53٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي درجة الحموضة ثلاثية 7.5 محلول ؛ 100 مل): يزن 53 جم من السكروز وينقل إلى أسطوانة متدرجة سعة 200 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer الرقم الهيدروجيني 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. اضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام H2O فائق النقاء.
ملاحظة: قم بإعداد هذا المحلول في أسطوانة متدرجة لضمان الدقة بسبب النسبة العالية من السكروز. يضاف شريط تقليب مغناطيسي ويحرك حتى يذوب السكروز تماما في المحلول. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات. - محلول تدرج السكروز isopycnic عالي الكثافة (73٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي من Tris pH 7.5 محلول ؛ 100 مل): يزن 73 جم من السكروز وينقل إلى أسطوانة متدرجة سعة 200 مل. أضف 100 ميكرولتر من 1 M Tris Buffer الرقم الهيدروجيني 7.5 و 200 ميكرولتر من 0.5 M EDTA pH 8. اضبط الحجم النهائي على 100 مل باستخدام H2O. عالي النقاء ، احفظه في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: قم بإعداد هذا المحلول في أسطوانة متدرجة لضمان الدقة بسبب النسبة العالية من السكروز. أضيفي شريط تقليب مغناطيسي وقلبي حتى يذوب السكروز تماما. قد تستغرق هذه العملية عدة ساعات. - المخزن المؤقت للتخزين الغشائي المعزول (10 ملي مولار Tris Buffer الرقم الهيدروجيني 7.5 ؛ 1 لتر): أضف 1 مل من 1 M Tris Buffer درجة الحموضة 7.5 إلى قارورة سعة 1 لتر واضبط الحجم النهائي على 1 لتر مع H2O فائق النقاء.
2. تحضير البكتيريا لاستخراج الغشاء
- تصف البكتيريا من مخزونات الجلسرين المجمدة على ألواح أجار طازجة. قم بتخزين الأطباق في درجة حرارة 4 درجات مئوية بمجرد نمو المستعمرات. تلقيح مستعمرة واحدة في أنبوب 5 مل مملوء بوسائط المرق وزراعة البكتيريا حسب الرغبة بين عشية وضحاها.
- قم بتخفيف المزرعة البكتيرية الليلية إلى 1 لتر من وسائط المرق المفضلة وزرع البكتيريا حتى يتم تحقيق الكثافة البصرية المطلوبة.
ملاحظة: يوصى بتلقيح مستعمرة بكتيرية واحدة في 1 لتر من وسائط المرق للأنماط الجينية الطافرة المعرضة لقمع الأنماط الظاهرية للنمو ، لكن بعض البكتيريا سالبة الجرام تنمو ببساطة بشكل أبطأ من غيرها. إذا لم يكن من الممكن تحقيق كثافة مزرعة كافية عن طريق التلقيح أحادي المستعمرة ، فإن التخفيف الخلفي للاستزراع الليلي إلى 1 لتر من الوسائط هو إحدى الاستراتيجيات لمزامنة النمو. يختلف تكوين الغشاء البكتيري اعتمادا على مرحلة نمو الثقافة (المرحلة اللوغاريتمية مقابل المرحلة الثابتة). يجب إجراء منحنيات النمو التي تقيس التغير في الكثافة البصرية للثقافات البكتيرية كدالة للوقت مع جميع السلالات لربط كثافة الثقافة بمرحلة النمو. - ضع القوارير التي تحتوي على مزارع المرق على الثلج. اقرأ الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) واحسب حجم الثقافة الذي يعادل ما بين 6.0 و 8.0 × 1011 وحدة تشكيل مستعمرة بكتيرية (CFU). بالنسبة إلى S. Typhimurium، يتوافق هذا مع 1 لتر من المزرعة عند OD600 بين 0.6 - 0.8، نظرا لأن OD600 من 1.0 يساوي تقريبا 1.0x109 CFU/mL. أضف هذا الحجم إلى أنبوب الطرد المركزي وتأكد من بقاء المزارع المتبقية على الجليد حتى يتم استخدامها.
- قم بتقطيع البكتيريا عن طريق الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية عند 7,000-10,000 × جم في جهاز طرد مركزي عالي السرعة بزاوية ثابتة لمدة 10 دقائق
ملاحظة: قم بتبريد أجهزة الطرد المركزي مسبقا والحفاظ عليها عند درجة حرارة منخفضة. احتفظ بالعينات على الجليد أثناء الإجراء بأكمله. - صب وتخلص من المادة الطافية بعناية.
ملاحظة: إذا لم يتم استخراج كسور الغشاء على الفور ، فيمكن تجميد الحبيبات و / أو تخزينها عند -80 درجة مئوية. ومع ذلك ، يوصى بالمضي قدما مباشرة في تحلل البلازما في نفس اليوم الذي يتم فيه حصاد الخلايا ، خاصة بالنسبة للأنواع غير المعوية.
3. تفكك الغشاء الخارجي وتحلل البلازما
- قم بإذابة كريات الخلية على الجليد إذا تم تخزينها مسبقا عند -80 درجة مئوية ، واحتفظ بالعينات على الجليد لبقية الإجراء. أعد تعليق كل حبيبات خلية داخل أنبوب الطرد المركزي في 12.5 مل من المخزن المؤقت أ. أضف قضيب تحريك مغناطيسي إلى تعليق الخلايا.
- أضف 180 ميكرولتر من 10 مجم / مل من الليزوزيم (التركيز النهائي 144 ميكروغرام / مل) إلى كل إعادة تعليق خلية. احتفظ بالعينات على الثلج مع التحريك لمدة 2 دقيقة.
- أضف 12.5 مل من محلول EDTA 1.5 ملي إلى كل إعادة تعليق خلية واستمر في التقليب على الثلج لمدة 7 دقائق إضافية.
- صب التعليق في أنبوب مخروطي 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 9,000-11,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المواد الطافية في حاوية نفايات بيولوجية واحتفظ بالكريات على الجليد.
- أضف 25 مل من المخزن المؤقت B إلى حبيبات الخلية.
- أضف 55 ميكرولتر من 1 M MgCl2 ، و 1 ميكرولتر من كاشف نوكلياز RNase / DNase (لتجنب مشاكل اللزوجة المرتبطة بالبكتيريا التي تخضع لتحلل البلازما قبل التجانس) ، و 1 ميكرولتر من كوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني إلى حجم المخزن المؤقت B الموجود فوق حبيبات الخلية
أعد - تعليق الحبيبات في خليط المخزن المؤقت B. ماصة ودوامة بقوة حتى ملاحظة محلول متجانس.
ملاحظة: من المهم جدا أن يكون لديك حل متجانس قبل الانتقال إلى الخطوة 4 من هذا البروتوكول. يجب أن يكون للخلايا المعلقة مظهر واتساق لزج يشبه خليط الكيك. - دوامة كل عينة لمدة 15 ثانية. احتفظ بالمعلقات على الجليد وانتقل إلى الخطوة 4.
4. التجانس والتحلل المضغوط
ملاحظة: يمكن استخدام عدة طرق للتحلل. صوتنة ليست مثالية بسبب توليد الحرارة. يمكن تحقيق التحلل التناضحي ، ولكنه غالبا ما يكون غير فعال. لذلك ، نوصي بتحلل الضغط العالي. يمكن تحقيق تحلل الضغط العالي باستخدام مجموعة متنوعة من الأدوات. نقترح آلات التجانس ، مثل الصحافة الفرنسية أو Emusliflex. نحن نعمل مع العديد من أنواع البكتيريا سالبة الجرام التي تختلف استجابتها لمحاليل السكروز الأسمولي العالي. تعمل خطوة التجانس بالضغط العالي على تحسين الكفاءة والاستنساخ والعائد.
قم
- بتبريد خلية الضغط الفرنسي مسبقا عند 4 درجات مئوية أو أدخل الملف المعدني من آلة الخالط على الثلج.
- صب العينة في خلية الضغط الفرنسي أو أسطوانة عينة الخالط واجعل الخلية تحت ضغط التجانس المطلوب (يجب أن يكون 10,000 رطل لكل بوصة مربعة كافيا عند استخدام مكبس فرنسي أو 20,000 رطل لكل بوصة مربعة عند استخدام الخالط).
- اضبط معدل تدفق المخرج على قطرة واحدة تقريبا في الثانية مع الحفاظ على الضغط في حالة استخدام مكبس فرنسي.
- اجمع محللة الخلية في أنابيب مخروطية سعة 50 مل مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد.
- كرر الخطوات 4.2-4.4 ثلاث إلى خمس مرات لتحقيق التحلل الكامل ، والذي يشار إليه عادة من خلال زيادة تدريجية في شفافية العينة.
ملاحظة: يجب غسل غرفة العينة وموازنتها مع Buffer B بين العينات. - احتفظ بالخلايا المحللة على الجليد.
5. تجزئة الغشاء الكلي
- الطرد المركزي للعينات البكتيرية المحللة عند 6،169 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات مادة الخلية السليمة المتبقية. (على سبيل المثال ، الخلايا البكتيرية غير المحللة).
- قم بتوزيع الجزء المتبقي من المادة الطافية ، والتي تحتوي الآن على الأغشية المتجانسة ، في زجاجة من البولي كربونات للطرد المركزي الفائق.
تنبيه: إذا لزم الأمر ، يمكن موازنة عينات الخلايا عن طريق التخفيف باستخدام المخزن المؤقت B. - جهاز طرد مركزي فائق تحلل الخلية عند 184،500 × جم لمدة ساعة واحدة على الأقل ، عند 4 درجات مئوية. يمكن تنفيذ هذه الخطوة بين عشية وضحاها دون التأثير على جودة الأغشية.
- تخلص من المادة الطافية المتبقية الموجودة في أنبوب الطرد المركزي الفائق واحتفظ بحبيبات الغشاء على الجليد (الشكل 1).
- أعد تعليق الكريات الغشائية في 1 مل من محلول التدرج الأيزوبيكني والسكروز منخفض الكثافة باستخدام الخالط الزجاجي. انقل العينة المتجانسة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام ماصة باستور زجاجية واحتفظ بها على الثلج.
ملاحظة: إذا كان التحليل الكلي لتكوين الغشاء مطلوبا فقط ، فاستبدل 1 مل من محلول التدرج المتدرج منخفض الكثافة ب 1 مل من المخزن المؤقت لتخزين الغشاء المعزول. الخطوة 5.5 هي نقطة نهاية العزل إذا كانت عينات الأغشية البكتيرية الإجمالية مطلوبة فقط. قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى يلزم إجراء مزيد من التحليل النهائي.
6. الكثافة المتدرجة الطرد المركزي الفائق لفصل الأغشية المزدوجة
- اجمع العدد المناسب من 13 مل من البولي بروبيلين أو الأنابيب المفتوحة فائقة الوضوح المحددة لدوار دلو متأرجح وجهاز طرد مركزي فائق.
- امسك الأنبوب في وضع مائل قليلا وقم بإعداد تدرج السكروز عن طريق إضافة محاليل السكروز ببطء من كثافة أعلى إلى كثافة أقل بالترتيب التالي: 2 مل من 73٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي درجة الحموضة تريس 7.54 مل من 53٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي درجة الحموضة ثلاثية 7.5
- التالي ، أضف جزء الغشاء الكلي (1 مل) ، والذي تم تعليقه في محلول السكروز 20٪ وزن / حجم (الخطوة 5.5). تجنب خلط جزء الغشاء مع محلول السكروز الموجود تحته. يجب أن تكون التقسيمات مرئية بين كل طبقة من هذه الطبقات.
- أخيرا ، املأ الأنبوب بمحلول التدرج المتدرج منخفض الكثافة isopycnic-sukrose (حوالي 6 مل). يجب ملء البولي بروبلين والأنابيب المفتوحة فائقة الوضوح ممتلئة قدر الإمكان (2 أو 3 مم من أعلى الأنبوب) لدعم الأنبوب.
- تعديل Acinetobacter baumannii 17978
- تكييف تدرج سكروز معدل للاستخدام مع العينات البكتيرية المختلفة. بالنسبة إلى A. baumannii ، أتاح تدرج السكروز التالي فصلا أكثر اكتمالا للأغشية (الشكل 2) .2 مل من 73٪ وزن / حجم من السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.54 مل من 45٪ وزن / حجم السكروز ، 1 ملي مولار EDTA ، 1 ملي مولار تريس الرقم الهيدروجيني 7.5
- بعد ذلك ، أضف جزء الغشاء الكلي (1 مل) ، والذي تم تعليقه في محلول السكروز بنسبة 20٪ وزن / حجم (الخطوة 5.5). تجنب خلط جزء الغشاء مع محلول السكروز الموجود تحته. يجب أن تكون التقسيمات مرئية بين كل طبقة من هذه الطبقات.
- أخيرا ، املأ الأنبوب بمحلول تدرج isopycnic-sukrose منخفض الكثافة (حوالي 6 مل). يجب ملء البولي بروبلين والأنابيب المفتوحة فائقة الوضوح ممتلئة قدر الإمكان (2 أو 3 مم من أعلى الأنبوب) لدعم الأنبوب.
- قم بأجهزة الطرد المركزي الفائقة للعينات باستخدام دوار دلو متأرجح عند 288,000 × جم و 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظة: بالنسبة للأحجام المستخدمة في الخطوات السابقة ، نوصي بأوقات الطرد المركزي بين 16 ساعة و 23 ساعة. - اقطع طرف ماصة P1000 على بعد حوالي 5 مم من النقطة. باستخدام الماصة، قم بإزالة طبقة الغشاء الداخلي ذات اللون البني العلوي (IM). انقل الكسر IM إلى زجاجة بولي كربونات للطرد المركزي الفائق.
- اترك حوالي 2 مل من محلول السكروز فوق واجهة 53-73٪ للتأكد من أن الغشاء الخارجي الأبيض السفلي (OM) غير ملوث بجزء IM. كرر إجراء سحب العينات من الخطوة 6.4 لجزء OM (الشكل 1).
ملاحظة: يمكن أيضا تجميع الأغشية عن طريق ثقب أنابيب الطرد المركزي في الأسفل بإبرة وتجميعها على شكل كسور متساقطة. - املأ الفراغ المتبقي من أنبوب الطرد المركزي الفائق بمخزن تخزين غشائي معزول واخلطه عن طريق الانعكاس أو سحب العينات. احتفظ بالعينات على الجليد.
- اجمع الأغشية المغسولة والمعزولة الآن عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 184،500 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
- تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الأغشية عن طريق التجانس المنخفض. أضف 500-1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتخزين. اجمع العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل.
- قم بتخزين عينات الغشاء البكتيري عند -20 درجة مئوية.
