تقييم تفاعلات الخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام حبيبات المحاكاة الحيوية

الملخص

المصدر: Stones، D.H.، et al. مواد المحاكاة الحيوية لتوصيف تفاعلات البكتيريا والمضيف. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو استخدام حبيبات البكتيريا لتحديد الالتصاق البكتيري لاستضافة الخلايا الظهارية في ظل ظروف تنافسية. يحدد الخطوات المتبعة في معالجة الخلايا ، وتحللها ، والتخفيفات التسلسلية لقياس وحدات تكوين المستعمرات.

البروتوكول

1. قياس الالتصاق البكتيري<ol style='list-style-type:decimal;'>
2. في النقاط الزمنية المحددة (على سبيل المثال، بعد ساعة واحدة من الإصابة)، قم بإزالة الوسائط من طبقة الخلية.
3. اغسل طبقة الخلية جيدا بمحلول ملحي معقم ودافئ مسبقا بالفوسفات (PBS) (3-4 غسلات على الأقل سعة 1 مل لكل منها) لإزالة أي خلايا غير متصلة.
4. الخلايا المضيفة ليز عن طريق إضافة 1 مل من محلول Triton X-100 المعقم بنسبة 1٪ v / v في PBS لكل بئر. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. ماصة كل عينة لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل نقل محتويات كل بئر لفصل أنابيب سعة 1.5 مل. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف من العينات إلى PBS معقمة (على سبيل المثال ، استخدم 100 مل من العينة و 900 مل من PBS).
6. لوحة 100 ميكرولتر من كل عينة على أجار لوريا بيرتاني البحرية (MLB) وانتشرها باستخدام موزع الخلايا. قم بتحسين التخفيفات التي يتم إجراؤها على اللوحة اعتمادا على السلالات البكتيرية والنقطة الزمنية.
   ملاحظة: بالنسبة للإعداد التجريبي الموصوف ، تعطي 10⁵ أو 10⁶ تخفيفات عددا مناسبا من وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs).
7. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية O / N وتعداد البكتيريا عن طريق عد المستعمرات.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Recodes Cordes Polystyrene Modified CarboxylateSigmaCLB9ضارة؛ تتوفر مجموعة من أحجام وألوان الجسيمات البديلةDulbecco's Modified Eagle's Medium - نسبة عالية من الجلوكوز - مع 4500 مجم / لتر من الجلوكوز وبيكربونات الصوديوم ، بدون L-glutamine ، وبيروفات الصوديوم ، وأحمر الفينول ، سائل ، مفلتر معقم ، مناسب لزراعة الخلاياSigmaD1145لتجارب العدوىDMEMSigmaD6429للحفاظ على الخلايا المضيفة المستنبتةمصل الأبقار الجنينية ،سيجماF9665 معطل بالحرارةمكمل لزراعة الأنسجة المتوسطةالبنسلين - الستربتومايسين - استقر المحلول ، مع 10,000 وحدة بنسلين و 10 مجم ستربتومايسين / مل ، معقم مفلتر ، كاشف حيوي ، مناسب لزراعة الخلايا ملحق SigmaF9665لزراعة الأنسجة المتوسطةPBSSigmaD8537 Plasticware 24 بئرGreiner662160 معدات مرافق زراعة الأنسجة ماصة متعددة القنوات