1. حصاد العينات لاستخراج البولي فوسفات
- : تنمو البكتيريا في ظل ظروف الاهتمام لتحديد محتوى polyP. لهذا البروتوكول, تنمو ملبنة روتيري بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز في تحريض إنزيم ماليك (MEI) وسط دون السيستين (MEI-C).
- حصاد ما يكفي من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ليصبح إجمالي 50-100 ميكروغرام من البروتين الخلوي (انظر الخطوة 3 أدناه). بالنسبة للإشريكية القولونية ، هذا هو 1 مل من ثقافة طور السجل عند A600 من 0.2 - 0.4. بالنسبة إلى L. reuteri ، هذا هو 1 مل من ثقافة بين عشية وضحاها. اضبط حسب الضرورة للأنواع الأخرى ذات الأهمية.
- قم بإزالة المادة الطافية تماما من كريات الخلية.
- أعد تعليق كريات الخلية في 250 ميكرولتر من محلول تحلل GITC (4 M جوانيدين إيزوثيوسيانات ، 50 ملي مولار تريس حمض الهيدروكلوريك ، الرقم الهيدروجيني 7) والليز عن طريق الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. قم بتخزين المحللات عند -80 درجة مئوية
ملاحظة: كن متسقا مع وقت التحلل ، لأن الحضانة الممتدة عند درجة حرارة عالية قد تؤدي إلى تدهور polyP عن طريق التحلل المائي. يمكن تخزين المحللات إلى أجل غير مسمى عند -80 درجة مئوية.
تنبيه: جوانيدين إيزوثيوسيانات هو ملح فوضوي ويجب التعامل معه بالقفازات والتخلص منه كنفايات خطرة.
2. قياس محتوى البروتين في محللات الخلايا
- قم بإعداد معايير ألبومين مصل الأبقار (BSA) التي تحتوي على 0 و 0.1 و 0.2 و 0.4 مجم مل -1 من BSA في مخزن تحلل GITC.
ملاحظة: من المهم وضع معايير BSA في GITC ، حيث يؤثر GITC على تطور لون اختبار برادفورد. يمكن تخزين معايير BSA إلى أجل غير مسمى عند -20 درجة مئوية. - Aliquot 5 ميكرولتر من محللات الخلايا المذابة والمختلطة جيدا ومعايير BSA لفصل الآبار في صفيحة شفافة مكونة من 96 بئرا.
- أضف 195 ميكرولتر من كاشف برادفورد إلى كل بئر وقم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر (A595) في قارئ الألواح (انظر جدول المواد).
- احسب كمية البروتين في كل بئر بالمقارنة مع منحنى BSA القياسي ، باستخدام الصيغة y = mx + b ، حيث y هو A595 ، x هو μg من BSA ، m هو ميل المنحنى القياسي ، و b هو تقاطع y للمنحنى القياسي. اضرب القيمة الناتجة في 0.05 لتحديد إجمالي ملغ البروتين في كل عينة.
3. استخراج البولي فوسفات
:
- أضف 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 95٪ إلى كل عينة محللة من GITC ودوامة للخلط.
- ضع هذا الخليط على عمود دوران غشاء السيليكا وجهاز طرد مركزي لمدة 30 ثانية عند 16,100 × جم.
- تخلص من التدفق ، ثم أضف 750 ميكرولتر من 5 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.5) ، و 50 ملي كلوريد الصوديوم ، و 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، و 50٪ إيثانول ، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية عند 16,100 × جم.
- تخلص من جهاز التدفق والطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 16,100 × جم.
- ضع العمود في أنبوب ميكرو فوج نظيف سعة 1.5 مل وأضف 150 ميكرولتر من 50 ملي من Tris-HCl (درجة الحموضة 8).
- احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق ، ثم قم بإزالة polyP عن طريق الطرد المركزي لمدة دقيقتين عند 8,000 × g.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين المواد المزاحة عند -20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.
4. هضم البولي فوسفات
- قم بإعداد المعايير التي تحتوي على 0 أو 5 أو 50 أو 200 ميكرومتر من فوسفات البوتاسيوم في 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 8).
ملاحظة: يمكن تخزين معايير فوسفات البوتاسيوم إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. - Aliquot 100 μL من كل معيار فوسفات ومن عينات polyP المستخرجة في آبار منفصلة من صفيحة واضحة 96 بئر.
- قم بإعداد مزيج رئيسي يحتوي على (لكل عينة): 30 ميكرولتر من 5x ScPPX المخزن المؤقت لتفاعل ScPPX (100 ملي مولار Tris-HCl ، 25 ملي مولار MgCl2 ، 250 ملي أسيتات الأمونيوم ، درجة الحموضة 7.5) 13 ، 19 ميكرولتر من H2O ، و 1 ميكرولتر من ScPPX المنقى (1 مجم مل -1).
- أضف 50 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من اللوحة المكونة من 96 بئرا. احتضن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين عينات polyP المهضومة عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
5. الكشف عن الفوسفات الحر
- قم بإعداد قاعدة محلول الكشف عن طريق إذابة 0.185 جم من طرطرات البوتاسيوم الأنتيمون في 200 مل من الماء ، وإضافة 150 مل من 4 نيوتن ساعة2SO4 ، ثم إضافة 1.49 جم من سباعي الأمونيوم. يقلب حتى يذوب ثم يصل إلى الحجم النهائي 456 مل. قم بتصفية المحلول لإزالة الجسيمات وتخزينه محميا من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- تحضير محلول مخزون من حمض الأسكوربيك 1 م. يحفظ محميا من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- قم بإعداد مخزون عمل جديد من محلول الكشف كل يوم عن طريق خلط 9.12 مل من قاعدة محلول الكشف مع 0.88 مل من حمض الأسكوربيك 1 M. اترك محلول الكشف يصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
- أضف 50 ميكرولتر من محلول الكشف إلى كل عينة ومعيار في اللوحة المكونة من 96 بئرا واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين تقريبا للسماح بتطوير اللون.
- قم بقياس الامتصاص عند 882 نانومتر باستخدام قارئ اللوحة واحسب تركيز الفوسفات لكل عينة بالمقارنة مع منحنى فوسفات البوتاسيوم القياسي.
تنبيه: يحتوي محلول الكشف على أملاح سامة وأحماض قوية. ارتد القفازات وتعامل مع المحلول الزائد كنفايات سامة.
6. حساب محتوى البولي فوسفات الخلوي
- قم بتحويل تركيزات الفوسفات المحددة في الخطوة 5.5 إلى نانومول من الفوسفات المشتق من polyP في كل محللة خلية بأكملها وفقا للصيغة التالية:
nmol polyP = 1.5 x (μM phosphate / 10)
ملاحظة: تحدد الطريقة القياسية القائمة على المنحنى في الخطوة 5 تركيز الفوسفات (بالميكرومتر) في كل عينة 100 ميكرولتر polyP مقتبسة في الخطوة 4.2. لتحويل هذا التركيز إلى عدد نانومول ، يتم قسمة 100 ميكرولتر على 106 لإعطاء حجم في L ، مضروبا في التركيز (ميكرومول L-1) ، ثم مضروبا في 1,000 (عدد nmol في ميكرومول). هذا يقلل إلى قسمة التركيز على 10. الحجم الكلي للمستخلص المحضر في الخطوة 3 هو 150 ميكرولتر ، لذلك من الضروري ضرب القيمة الناتجة في 1.5 لحساب نانومول الفوسفات الموجود في المستخلص بأكمله. - تطبيع محتوى polyP الخلوي إلى البروتين الخلوي الكلي عن طريق قسمة nmol polyP على إجمالي البروتين في كل عينة محددة في الخطوة 1.4. يتم التعبير عن مستويات PolyP من حيث تركيز الفوسفات الحر المشتق من polyP.
ملاحظة: في بعض الحالات ، قد تقع كمية الفوسفات المشتق من polyP الموجودة في العينة خارج النطاق الخطي لمنحنى معيار الفوسفات. إذا كانت مستويات polyP عالية جدا ، فيمكن تخفيف الشفط الزائد المحتوي على polyP من الخطوة 3.6 1:10 أو 1:100 ، حسب الضرورة ، ثم قياسه مرة أخرى كما هو موضح في الخطوات من 4 إلى 6.
