اختبار للقياس الكمي للبولي فوسفات غير العضوي في البكتيريا

الملخص

المصدر: Pokhrel، A.، et al. فحص البولي فوسفات غير العضوي في البكتيريا. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس البولي فوسفات غير العضوي (polyP) في العينات البكتيرية. يتضمن الإجراء تحويل polyP إنزيميا إلى فوسفات حر ، والذي يتفاعل بعد ذلك مع الموليبدات وحمض الأسكوربيك لإنتاج مركب أزرق اللون. من خلال مقارنة امتصاص هذا المركب بمنحنى قياسي لتركيزات الفوسفات المعروفة ، يمكن قياس محتوى polyP في العينات البكتيرية بدقة.

البروتوكول

1. حصاد العينات لاستخراج البولي فوسفات

1. : تنمو البكتيريا في ظل ظروف الاهتمام لتحديد محتوى polyP. لهذا البروتوكول, تنمو ملبنة روتيري بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز في تحريض إنزيم ماليك (MEI) وسط دون السيستين (MEI-C).
2. حصاد ما يكفي من الخلايا عن طريق الطرد المركزي في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ليصبح إجمالي 50-100 ميكروغرام من البروتين الخلوي (انظر الخطوة 3 أدناه). بالنسبة للإشريكية القولونية ، هذا هو 1 مل من ثقافة طور السجل عند A₆₀₀ من 0.2 - 0.4. بالنسبة إلى L. reuteri ، هذا هو 1 مل من ثقافة بين عشية وضحاها. اضبط حسب الضرورة للأنواع الأخرى ذات الأهمية.
3. قم بإزالة المادة الطافية تماما من كريات الخلية.....

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات E. coli BL21 (DE3) Millipore Sigma69450 LB مرقفيشر ScientificBP1427-2بكتريا قولونية نمو متوسطأمبيسلينفيشر ScientificBP176025 كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) فيشر ساینتفيكS27110 كلوريد المغنيسيوم (MgCl₂) فيشر ساينتفيكBP214-500 كاشف برادفوردبيو راد5000205 تريس عازلةفيشر ScientificBP1525 حمض الهيدروكلوريك (HCl) فيشر ScientificA144-212لضبط درجة الحموضة في محاليل تريس المخزنةكلوريد البوتاسيوم (KCl) فيشر P217500 الجلسرينفيشر ScientificBP2294 10x MOPS خليط متوسطTeknovaM2101بكتريا قولونية نمو متوسطالجلوكوزفيشر ScientificD161 فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH₂PO₄) فيشر ScientificBP362-500 فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K₂HPO₄)مستخلص الخميرة المجففة فيشر Scientific BP363-500 فيشر ScientificDF0886-17-0 التربتونفيشر ScientificBP1421-500 كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدراتفيشر ScientificM63-50 أحادي هيدرات كبريتات المنغنيز فيشر ScientificM113-500 جوانيدين إيزوثيوسياناتفيشر ScientificBP221-250 ألبومين مصل الأبقار (خالي من البروتياز)فيشر ساينتفيكBP9703100 شفاف مسطح القاع 96 ألواحسيجما ألدريتشM0812-100EAأي ستعمل اللوحة الشفافة المكونة من 96 بئرTecan M1000 Infinite Plate ReaderTecan، Inc.لا ينطبقأي قارئ لوحة قادر على قياس الامتصاص عند 595 و 882 نانومتر سيعملالإيثانولفيشر ساينتفيك04-355-451 أعمدة دوران غشاء السيليكاEpoch Life Science1910-050 / 250 حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)فيشر ساينتفيكBP120500 1.5 مل أنابيب الطرد الدقيقفيشر العلميةNC9580154 أسيتات الأمونيومفيشر ScientificA637-500 أنتيمون طرطرات البوتاسيومفيشر ساينتفيكAAA1088922 4 N حمض الكبريتيك (H₂SO₄)فيشر ساينتفيكSA818-500 الأمونيوم سباعي البوتموليبداتفيشر AAA1376630 العلميحمض الأسكوربيكفيشر AC401471000 العلمي