فحص تكاثر الفيلقية الرئوية في البلاعم المعالجة مسبقا بحويصلات الغشاء الخارجي

الملخص

المصدر: Jung، A. L. et al.، Legionella pneumophila حويصلات الغشاء الخارجي: عزل وتحليل إمكاناتها المؤيدة للالتهابات على الضامة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو المعالجة المسبقة للبلاعم باستخدام حويصلات الغشاء الخارجي الفيلقية الرئوية (OMVs) لفحص تأثيرها على تكاثر البكتيريا. من خلال تغيير الإشارات المناعية للمضيف ، تجعل OMVs البلاعم أكثر تساهلا بالعدوى. يشير ارتفاع عدد المستعمرات في الخلايا المعالجة ، مقارنة بالخلايا غير المعالجة ، إلى أن OMVs تعزز تكاثر L. pneumophila داخل الضامة.

البروتوكول

1. البلاعم المعالجة المسبقة

1. قم بإعداد خلايا THP-1 (خلايا طب الأطفال في مستشفى توهوكو -1 ، خط خلايا سرطان الدم أحادي الخلية البشرية).
   ملاحظة: THP-1 هو خط خلية أحادي الخلية مشتق من مريض سرطان الدم.
   1. أضف 2 × 10⁵ خلايا THP-1 لكل 24 بئرا وقم بتمييزها عن طريق إضافة 20 نانومتر فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) في خلايا شبيهة بالبلاعم. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   2. استبدل الوسط ب 500 ميكرولتر من الوسط الطازج واحتضنه لمدة 24 ساعة أخرى ؛ الوسط الأمثل لخلايا THP-1 يشتمل على نسبة عالية من الجلوكوز المتوسط (RPMI) 1640 مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪.
2. عزل الضامة المشتقة من نخاع عظم الفئران (mBMDM).
3. عالج البلاعم المشتقة من THP-1 أو mBMDM باستخدام حويصلات الغشاء الخارجي (OMVs).
   1. قم بإذابة OMVs وإضافتها إلى البلاعم البشرية أو الفئران وفقا لكمية البروتين (0.1 و 1 و 10 ميكروغرام / مل). احتضان البلاعم باستخدام OMVs عند 37 درجة مئوية لمدة 20 ساعة على الأقل.

2. إصابة البلاعم وتقييم التكاثر البكتيري باستخدام وحدة تشكيل المستعمرة (CFU) فحص

1. استخدام الفيلقية الرئوية أو خلايا THP-1 المعالجة مسبقا أو mBMDM من الخطوة 4.3 ، وليس الضامة المعالجة مسبقا كعناصر تحكم (2 × 10⁵/24 آبار). لا تستبدل الوسيط.
2. تصيب خلايا THP-1 ب L. pneumophila Corby WT و mBMDM بتحور يفتقر إلى السوط من L. pneumophila Corby (كلاهما مع تعدد العدوى (MOI) 0.5 ؛ 1x10⁵ L. pneumophila / 24 بئر) واحتضانه لمدة 24 و 48 ساعة على التوالي.
3. قم بتحلل الخلايا في وسطها عن طريق إضافة الصابونين (التركيز النهائي: 0.1٪) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
4. أعد تعليق البكتيريا عن طريق سحب العينات وانقل التعليق إلى وعاء التفاعل. تحضير التخفيفات التسلسلية للوسائط المحتوية على L. pneumophila في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS).
5. قم بوضع 50 ميكرولتر من التخفيفات المطلوبة على ألواح أجار مستخلص خميرة الفحم المخزنة (BCYE) واحتضانها لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية.
6. عد المستعمرات المشكلة بصريا. احسب CFU

<

img class='image_resized' style='aspect-ratio:305/40;width:75٪;' src='https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/23949/Equation_1_editor_23949.jpg' alt='Equation_1.jpg' />

تطبيع نتيجة عدد CFU لعدم المعالجة مسبقا ولكن الضامة المصابة، والتي تم ضبطها على 100٪.

المواد

< الرقم class = 'table'>

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10 cm petridish	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht ، ألمانيا)	82.1473
الفحم المنشط	Carl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)	X865.2
Agar-agar ، Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)	5210.2
كولومبيا أجار مع 5٪ من دم الأغنام	Becton Dickinson GmbH (هايدلبرغ ، ألمانيا)	254005
نترات الحديديك nonahydrate	Carl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)	5632.1
مصل عجل الجنين (FCS)	Life Technologies GmbH (دارمشتات ، ألمانيا)	10270-106
Heracell 240i حاضنة ثاني أكسيد الكربون	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (براونشفايغ ، ألمانيا)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (براونشفايغ ، ألمانيا)	75004515
حلقة التلقيح	Sarstedt AG & Co KG (نومبرشت ، ألمانيا)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---	يرجى تقديم الأستاذ الدكتور أنتجي فليجر (RKI ، برلين ، ألمانيا)
L. pneumophila Corby ΔflaA	------		يرجى تقديم الأستاذ الدكتور كلاوس هونر (RKI ، برلين ، ألمانيا)
mBMDM	---	---	يرجى تقديم البروفيسور الدكتور ماركوس شنار (جامعة فيليبس ماربورغ ، ماربورغ ، ألمانيا) والبروفيسور الدكتور كارستن كيرشنينج (جامعة دويسبورغ إيسن ، إيسن ، ألمانيا) PBS
	Biochrom GmbH (برلين ، ألمانيا)	L 1825
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen ، ألمانيا)	P8139-1MG
شاكر دوار (MaxQ 6000) Thermo	Fisher Scientific Germany BV & Co KG (براونشفايغ ، ألمانيا)	SHKE6000
RPMI 1640 High Glucose	Life Technologies GmbH (دارمشتات ، ألمانيا)	11875-093
Saponin	Carl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (كامبريدج ، إنجلترا)	80-2116-30
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen ، ألمانيا)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (براونشفايغ ، ألمانيا)
مستخلص الخميرة	Carl Roth GmbH & Co KG (كارلسروه ، ألمانيا)	2363.2