إجراء لحصاد البكتيريا والتحلل الميكانيكي

الملخص

المصدر: Mercier، N.، et al. تنقية MS2-Affinity إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا موجبة الجرام. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو إجراء خطوة بخطوة لحصاد الخلايا البكتيرية وتحللها ميكانيكيا لإطلاق محتويات داخل الخلايا.

البروتوكول

1. حصاد البكتيريا

تنبيه: تتضمن هذه الخطوة التعامل مع البكتيريا المسببة للأمراض.

1. قم بزراعة مستعمرة واحدة من السلالات التي تحمل إما pCN51-P3-MS2-sRNA أو pCN51-P3-MS2 في 3 مل من وسط تسريب قلب الدماغ (BHI) المكمل بالإريثروميسين (10 ميكروغرام / ميكرولتر) في نسخ مكررة.
2. قم بتخفيف كل مزرعة ليلية في 50 مل (≈1/100) من وسط BHI الطازج المكمل بالإريثروميسين (10 ميكروغرام/ميكرولتر) للوصول إلى OD_600nm من 0.05. استخدم 250 مل من قوارير معقمة (نسبة 5: 1 قارورة إلى متوسطة).
   ملاحظة: يجب ضبط الظروف المتوسطة والنمو وفقا لنمط التعبير عن الحمض النووي الريبي المدروس.
3. قم بزراعة المزارع عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 180 دورة في الدقيقة لمدة 6 ساعات.
4. انقل كل ثقافة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
5. جهاز الطرد المركزي عند 2,900 × جم خلال 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
6. احتفظ بالكريات على الجليد وقم بإجراء تحلل الخلايا الميكانيكية أو تجميدها مباشرة وتخزين الكريات عند -80 درجة مئوية.

2. تحلل الخلايا الميكانيكية

تنبيه: يجب تنفيذ الخطوات التالية على الجليد ويجب أن تكون المخازن المؤقتة عند 4 درجات مئوية. استخدم القفازات واتخذ جميع الاحتياطات لحماية العينات من RNases.

1. أعد تعليق الكريات (الخطوة 1.6) في 5 مل من المخزن المؤقت A (150 ملي كلوريد كلوريد ، 20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8 ، 1 ملي ملي مجم_{كلوريد 2} و 1 ملي DTT).
2. انقل الخلايا المعلقة في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل مع 3.5 جم من حبات السيليكا (0.1 مم).
3. أدخل الأنابيب في أداة تحلل الخلايا الميكانيكية. قم بتشغيل دورة مدتها 40 ثانية بسرعة 4.0 م / ث
   ملاحظة: إذا لم تكن دورة واحدة كافية لكسر الخلايا ، فاترك الجهاز يبرد لمدة 5 دقائق مع الاحتفاظ بالعينات على الجليد. بعد ذلك، كرر دورة أخرى مدتها 40 ثانية بسرعة 4.0 م/ث. يمكن اختبار كفاءة تحلل الخلية عن طريق طلاء المادة الطافية على لوحة BHI-agar.
4. جهاز طرد مركزي عند 15,700 × جم لمدة 15 دقيقة.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 15 مل أنابيب الطرد المركزيFalcon352070 50 مل Falcon352051 250 مل قارورة ثقافةDominique Dutscher2515074الثقافات البكتيريةمرق BHI (تسريب قلب الدماغ)Sigma-Aldrich53286وسط النموErythromycin (ery) Sigma-AldrichFluka 45673متوسط النموLysing Matrix B BulkMP Biomedicals6540-428التحلل الميكانيكيRNAPro SolutionMP Biomedicals6055050التحلل الميكانيكيجهاز FastPrepMP Biomedicals116004500 مقياس الطيف الضوئي للتحلل الميكانيكيGenesys 20ThermoFisher Scientific11972278الثقافات البكتيرية