عزل الحمض النووي الريبي البكتيري المستهدف المرتبط بالحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير باستخدام تنقية التقارب

الملخص

المصدر: Mercier، N.، وآخرون، تنقية MS2-Affinity إلى جانب تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا موجبة الجرام. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو عزل الحمض النووي الريبي التنظيمي الصغير (sRNA) المرتبط بالحمض النووي الريبي البكتيري المستهدف باستخدام تنقية التقارب مع اندماج بروتين معطف المالتوز (MBP) - MS2 الثابت على راتنج الأميلوز.

البروتوكول

المخازن المؤقتة والوسائط

لتجارب MAPS ، قم بإعداد المخازن المؤقتة والوسائط التالية: - Buffer A (150 ملي KCl ، 20 ملي Tris-HCl pH 8 ، 1 ملي ملي MgCl₂ و 1 ملي DTT) - العازلة E (250 ملي KCl ، 20 ملي Tris-HCl درجة الحموضة 8 ، 12 ملي مالتوز ، 0.1٪ تريتون ، 1 ملي مللي كلوريد₂ و 1 ملي مولار DTT)

تحضير

العمود

تنبيه: احرص على عدم ترك راتنج الأميليوز يجف. إذا لزم الأمر ، أغلق العمود بغطاء نهاي. تحضير جميع المحاليل قبل البدء في تنقية التقارب.

1. ضع عمود كروماتوغرافيا في رف أعمدة.
2. قم بإزالة طرف العمود واغسل العمود بالماء فائق النقاء.
3. أضف 300 ميكرولتر من راتنج الأميلوز.
4. اغسل العمود ب 10 مل من Buffer A.
5. قم بتخفيف 1,200 مليون من بروتين MBP (بروتين مرتبط بالمالتوز) -MS2 في 6 مل من Buffer A وتحميله في العمود.
6. اغسل العمود ب 10 مل من Buffer A.

تنقية تقارب MS2 (الشكل 1)

1. قم بتحميل محللة الخلية في العمود.
   ملاحظة: احتفظ ب 1 مل من محللة الخلية (المستخلص الخام ، CE) لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي وإجراء تحليل اللطخة الشمالية والنسخ.
2. اجمع الكسر المتدفق (FT) في أنبوب تجميع نظيف.
3. اغسل العمود 3 مرات باستخدام 10 مل من المخزن المؤقت A. اجمع جزء الغسيل (W).
4. قم بتقطيع العمود ب 1 مل من Buffer E واجمع جزء الشطف (E) في أنبوب دقيق سعة 2 مل.
5. احتفظ بجميع الكسور المجمعة على الجليد حتى استخراج الحمض النووي الريبي أو قم بتجميدها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

النتائج

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>

الشكل 1. رسم تخطيطي لبروتوكول MAPS تم تكييفه مع المكورات العنقودية الذهبية. من بناء البلازميد إلى تحليل البيانات.

المواد

<فئة الشكل = 'الجدول'><فئة الجدول = 'ck-table-resize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1.5 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق Sarstedt72.690.001 15 مل أنابيب الطرد المركزيFalcon352070 2 مل أنبوب الطرد المركزيالدقيق Starstedt72.691 قارورة ثقافة 250 ملدومينيك دوتشر2515074الثقافات البكتيرية50 مل أنابيب الطرد المركزيفالكون352051الثقافة الطرد المركزيراتنج الأميلوزنيو إنجلاند BioLabsE8021SMS2-تقارب تنقيةpMBP-MS2Addgene65104MS2-MBP إنتاجعمود كروماتوغرافيا Poly-PrepBioRad7311550تنقية MS2