$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تحضير السلالات البكتيرية أو المكتبات الطافرة
< p style='margin-left: 40px;'>
1. قم بإخراج السلالات المراد اختبارها على ألواح أجار مناسبة. هذه لوحات مخزون للتجربة.1. احتضان الألواح طوال الليل عند درجة الحرارة المطلوبة لتحقيق مستعمرات مفردة. في هذه التجربة ، استزراع K. pneumoniae (NTUH-K2044 و ATCC43816 سلالات) على مرق لوريا (LB) أجار عند 37 درجة مئوية ، و S. pneumoniae (23F النوع البري و 23F Δcps) على أجار الدم في جرة شمعة رطبة عند 37 درجة مئوية.
2. اختر مستعمرة واحدة من طبق مخزون (الخطوة 1.1) لتلقيح 10 مل من المرق المناسب باستخدام حلقة معقمة أو عصا كوكتيل. لفحص المكتبات الطافرة العشوائية ، قم بتلقيح المرق ب 10 ميكرولتر من مخزون المكتبة المتحولة العشوائية (مكتبة TraDIS).
1. احتضان سلالات K. pneumoniae في وسط LB منخفض الملح عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز ، و S. pneumoniae سلالات في وسائط ضخ القلب في الدماغ (BHI) ، بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية.
2. انقل المزرعة الليلية إلى أنبوب سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء لمدة 10 دقائق عند 3,200 × جم في دلاء متأرجحة مع إدراج أنبوب سعة 15 مل وأغطية محكمة للهباء الجوي.
3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
NOTE: تخلص من المادة الطافية عبر طريق النفايات البيولوجية السائلة المناسبة في المختبر. الغرض من خطوات الطرد المركزي وإعادة التعليق (1.2.2 و 1.2.3) هو تركيز البكتيريا لسهولة التصور على التدرج. يمكن تحميل الثقافات البكتيرية مباشرة على التدرج إذا كنت تفضل ذلك. قد لا تشكل السلالات ذات الكبسولات الثقيلة حبيبات ضيقة. إذا حدث هذا ، فقم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية دون إزالة أي خلايا بكتيرية ، وأضف 1x PBS إلى الحجم النهائي البالغ 5 مل ، وأعد تعليق الحبيبات. تابع البروتوكول مع الخطوة 1.2.5.
5. الطرد المركزي للأنابيب كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
6. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من 1x PBS. الخلايا جاهزة الآن للاستخدام.
NOTE: كثافة تعليق الخلية البكتيرية ليست critica، ولكن يجب أن تكون كافية للتصور في التدرج. يقترح الحد الأدنى OD600 (الكثافة البصرية عند 600 نانومتر) من 4.