فحص In Vivo لربط التلألؤ البيولوجي البكتيري بكثافة الخلايا

الملخص

المصدر: Brodl, E., et al. القياس في الموقع وارتباط كثافة الخلايا وانبعاث الضوء للبكتيريا المضيئة بيولوجيا. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو قياس وارتباط التلألؤ البيولوجي بكثافة الخلايا في البكتيريا المحولة. يتم استخدام مستعمرة بكتيرية واحدة لبدء ثقافة سائلة. يتم وضع المزرعة في بئر بتركيز الخلية المطلوب. يضاف مضاد حيوي ومحفز للتعبير عن الجين المطلوب للتلألؤ البيولوجي البكتيري. تؤخذ قراءات الامتصاص والتلألؤ البيولوجي على فترات منتظمة باستخدام قارئ الألواح.

البروتوكول

1. تصميم وإعداد والتعبير عن لوكس أوبرون في الإشريكية القولونية

ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على معلومات حول المجموعات التجارية المستخدمة في هذا القسم.

1. لنقل أوبرون لوكس إلى بكتريا قولونية ، اختر متجه pET قياسي مع مواقع تقييد مناسبة وجين مقاومة المضادات الحيوية محل الاهتمام (على سبيل المثال ، pET28a ؛ NcoI ، XhoI ، كاناميسين).
2. صمم الشظايا والبادئات المتداخلة لتجميع جيبسون بناء على تسلسل الحمض النووي للبكتيريا الضوئية mandapamensis 27561 (GenBank: DQ988878.2).
3. قم بإعداد تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (PCR) مع الاشعال المصممة والحمض النووي الجيني المعزول (حمض الديوكسي ريبونوكلييك) للبكتيريا الضوئية mandapamensis 27561 كقالب.
   ملاحظة: عزل الحمض النووي الجيني للسلالة البكتيرية المعنية يعزز فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
قم
4. بتنقية منتج PCR عن طريق تنقية العمود الدوار.
5. قم بإجراء عملية الهضم التقييدي لناقل pET28a المعزول باستخدام NcoI و XhoI عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
6. تنقية الناقل الخطي وشظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز وتنقية العمود الدوراني اللاحقة.
7. حدد تركيز الحمض النووي لكل جزء والمتجه الخطي ، واحسب الكميات المثلى للتجميع وفقا للبروتوكول.
   ملاحظة: تعتمد فعالية التجميع على حجم الجزء ورقمه ويجب تعديله وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
8. بعد الجمع بين جميع الأجزاء والمخزن المؤقت في أنبوب PCR ، قم باحتضان خليط التجميع في جهاز PCR عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
9. قم بتحويل منتج الناقل المجمع وفقا لبروتوكولات التحويل القياسية للإشريكية القولونية تحويل البلازميد البكتيري إلى نظام بكتريا قولونية مناسب لتكرار البلازميد عالي الإنتاجية (على سبيل المثال ، الإشريكية القولونية TOP10 أو XL-1).
10. اختر المستعمرات من لوحة التحويل وخطها على لوحات جديدة لعزل الحمض النووي.
11. عزل الحمض النووي البلازميد وفقا للبروتوكولات القياسية.
12. للتحقق من التجميع الصحيح للبلازميد ، بما في ذلك جميع الأجزاء ، قم أولا بإجراء مستعمرة PCR وفقا للبروتوكولات القياسية باستخدام مواد أولية خاصة بكل جزء مجمع.
13. بالإضافة إلى مستعمرة PCR والرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز اللاحق ، قم بإعداد جميع نواقل التجميع المعزولة لتسلسل الحمض النووي للتحقق من التجميع الصحيح وتسلسل الحمض النووي الصحيح.
14. قم بتحويل البلازميد الذي تم التحقق منه وفقا لبروتوكولات التحويل القياسية للإشريكية القولونية تحويل البلازميد البكتيري إلى نظام الإشريكية القولونية المناسب لإنتاج البروتين عالي الغلة (على سبيل المثال ، الإشريكية القولونية BL21).
    ملاحظة: استمر مباشرة مع بروتوكول التعبير أدناه. للتخزين لفترة أطول ، يوصى بإعداد مخزون الجلسرين.

2. التعبير عن سلالات الإشريكية القولونية المعدلة

1. قم بإعداد ثقافة ليلية (ONC) للتعبير عن طريق تلقيح حجم مناسب من وسط لوريا بيرتاني (LB) (على سبيل المثال ، 100 مل) مع مخزون الجلسرين المعد مسبقا من بكتريا قولونية خلايا BL21 التي تم تحويلها باستخدام البلازميد المجمع أو مباشرة من لوحة التحويل. أضف 100 ميكرولتر من الكاناميسين (50 مجم / مل ؛ جين مقاومة المضادات الحيوية ل pET28a) واحتضن ONC عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة طوال الليل.
2. تلقيح ثقافة التعبير الرئيسي (على سبيل المثال ، 800 مل من وسط LB) ب 8 مل من ONC وأضف 800 ميكرولتر من الكاناميسين (50 مجم / مل).
3. احتضان الثقافة الرئيسية عند 37 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة حتى تصل كثافة الخلية إلى OD₆₀₀ من 0.6 - 0.8 (حوالي 2.5 ساعة).
4. خفض درجة حرارة الحضانة إلى 28 درجة مئوية.
5. تحفيز التعبير عن البروتين عن طريق إضافة البروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) إلى التركيز النهائي البالغ 0.1 ملي.
   ملاحظة: أظهرت الاختبارات التجريبية أن خفض درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية أعطى أعلى شدة ضوء.
6. راقب الخلايا حتى تبدأ في التألق (حوالي 1 ساعة).
   ملاحظة: اعتمادا على الغرض من التعبير ، تنمو الخلايا حتى اليوم التالي ثم يتم حصادها ، أو يمكن الحفاظ على اهتزاز الخلايا طالما أنها مشرقة (بحد أقصى 48 ساعة). يمكن حصاد الخلايا وتنقية أي بروتينات وفقا للإجراءات القياسية.

3. التعبير عن سلالات التلألؤ الحيوي البكتيرية

ملاحظة: تتطلب السلالات البكتيرية المضيئة الحيوية وسط نمو محدد / وسط مياه البحر الاصطناعي للنمو وإنتاج الضوء.

1. تحضير وسط مياه البحر الاصطناعي المكون من مكونين متوسطين مجهزين بشكل منفصل. / >ملاحظة: الكميات التالية هي ل 1 لتر من وسط سائل أو 1 لتر من وسط أجار.
   1. بالنسبة لوسط مياه البحر الاصطناعية ، قم بوزن الأملاح التالية: 28.13 جم كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، 0.77 جم كلوريد الصوديوم (كلوريد البوتاسيوم) ، 1.60 جم كلوريد الكالسيوم₂ · 2 ساعة₂درجة (ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم) ، 4.80 جم MgCl₂ · 6H₂O (سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم) ، 0.11 جم NaHCO₃ (بيكربونات الصوديوم) ، و 3.50 جم MgSO₄ · 7H₂O (هيبتاهيدرات كبريتات المغنيسيوم).
   2. أضف 1 لتر من الماء المقطر وقم بإذابة جميع المكونات.
   3. بالنسبة لوسط LB ، قم بوزن المكونات التالية: 10 جم من مستخلص الخميرة ، و 10 جم بيبتون ، وبالنسبة لأطباق الأجار ، 20 جم أجار إضافي.
   4. أضف 250 مل من ماء الصنبور وقم بإذابة المكونات.
   5. الأوتوكلاف كلا الوسائط المعدة بشكل منفصل عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   6. بالنسبة لألواح الأجار ، امزج 250 مل من وسط LB مع 750 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي مباشرة بعد التعقيم وتحضير الألواح.
   7. بالنسبة للوسط السائل ، امزج 250 مل من وسط LB مع 750 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي إما مباشرة بعد التعقيم أو عند تبريده.
      ملاحظة: قد يصبح وسط مياه البحر الاصطناعي عكرا من خلال ترسيب الملح.
2. قم بربط السلالات البكتيرية المضيئة بيولوجيا على ألواح أجار متوسطة مياه البحر الاصطناعية واحتضانها طوال الليل عند 24 - 30 درجة مئوية.
   ملاحظة: عادة ما يتم تحقيق التخزين لفترة طويلة للسلالات البكتيرية من خلال تجميد مخزونات الجلسرين للثقافة البكتيرية. يجب دائما أن تكون السلالات مخططة على ألواح الأجار أولا لضمان ظروف بدء موحدة لجميع السلالات ، قبل استخدامها في المزارع السائلة ، بسبب مرحلة التأخر في النمو بعد الذوبان.
3. قم بإعداد ONC عن طريق تلقيح 100 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي بمستعمرة واحدة من اللوحة. احتضان ONC عند 24 - 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة طوال الليل.
4. تلقيح 800 مل من وسط مياه البحر الاصطناعي مع 8 مل من ONC.
5. احتضان الخلايا البكتيرية عند 24 - 30 درجة مئوية و 120 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة.
   ملاحظة: يختلف ملف تعريف شدة الضوء للبكتيريا الحيوية بشدة باختلاف درجة الحرارة. اعتمادا على الآليات التنظيمية لإنتاج الضوء للسلالة البكتيرية المعنية ، قد يبدأ انبعاث الضوء بعد حوالي 1-6 ساعات.
6. راقب مزارع الخلايا البكتيرية حتى تبدأ في التألق (حوالي 1 - 6 ساعات).
   ملاحظة: اعتمادا على الغرض من التعبير ، تنمو الخلايا حتى اليوم التالي ثم يتم حصادها ، أو يمكن الحفاظ على اهتزاز الخلايا طالما أنها مشرقة. يمكن حصاد الخلايا وتنقية أي بروتينات وفقا للإجراءات القياسية.

4. فحص النشاط في الجسم الحي للسلالات البكتيرية الحيوية والسلالات المعدلة الإشريكية القولونية

ملاحظة: عادة ما يتم تحقيق تخزين السلالات لفترة طويلة من خلال تجميد مخزونات الجلسرين للثقافة البكتيرية. يجب دائما أن تكون السلالات مخططة على ألواح الأجار أولا لضمان ظروف بدء موحدة لجميع السلالات ، قبل استخدامها في المزارع السائلة ، بسبب مرحلة التأخر في النمو بعد الذوبان.

1. قم بربط السلالة البكتيرية المضيئة بيولوجيا المرغوبة أو سلالة الإشريكية القولونية المعدلة على صفيحة أجار واحتضانها عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف درجة حرارة الحضانة من سلالة إلى أخرى ويجب تقييمها تجريبيا. لتكون قادرا على مقارنة السلالات البكتيرية المضيئة بيولوجيا وسلالات الإشريكية القولونية المعدلة ، يجب أن تكون ظروف النمو متطابقة.
2. تلقيح 3 مل من الوسط بالسلالة المعنية بمستعمرة واحدة من صفيحة أجار واحتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية و 180 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة لمدة 1 - 2 ساعة تقريبا.
3. قم بقياس كثافة الخلية لتخفيف 1:10 للثقافة السائلة عند 650 نانومتر. احسب النسبة والحجم لثقافة 1 مل باستخدام OD650 0.05.
   ملاحظة: سيحدد مقايسة قارئ اللوحة اللاحقة كثافة الخلية عند 650 نانومتر لتجنب التداخل بواسطة انبعاث الضوء للسلالات.
4. ماصة الحجم المحسوب للثقافة والوسط في صفيحة ذات جدران سوداء 24 بئرا مع قاع زجاجي. بالنسبة للبكتريا القولونية المعدلة سلالة ، أضف 1 ميكرولتر من الكاناميسين (مقاومة المضادات الحيوية لناقل pET28a) و 1 ميكرولتر من IPTG (تحريض التعبير الجيني) إلى العينات. ضع غطاءا على اللوحة لتجنب التبخر أثناء القياسات.
   ملاحظة: للتأكد من أن متجه pET28a الذي يحتوي على مشغل لوكس بالكامل لا يضيع بواسطة ثقافة الإشريكية القولونية ، يجب إضافة الكاناميسين إلى كل عينة من الإشريكية القولونية في آبار الصفائح ولضمان إمكانية قياس إنتاج الضوء لخلايا الإشريكية القولونية ، يجب أن يتم تحفيز التعبير الجيني بواسطة IPTG. لتجنب الحديث المتبادل وتداخل القياس ، أظهرت ألواح الآبار ذات الجدران السوداء ذات القيعان الزجاجية والأغطية الشفافة أفضل النتائج. ومع ذلك ، يمكن ملاحظة الحديث المتبادل ، ويجب اختيار المواقف الجيدة بعناية.
5. ابدأ القياس في قارئ لوحة.
   ملاحظة: يعتمد بروتوكول قارئ اللوحة على برنامج نصي تم تطويره خصيصا لهذا الاختبار يجمع بين قياسين ، الامتصاص والتلألؤ البيولوجي. يتم جمع نقاط البيانات كل 10 دقائق مع اهتزاز دائم بين القياسات ودرجة حرارة ثابتة تبلغ 28 درجة مئوية.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات NEBuilder High Fidelity DNA Assembly Simulator Kit New England Biolabs Inc.E2621Sل 10rxndx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad Phusion PolymeraseThermo ScientificF530S Q5 عالية الدقة DNA PolymeraseNew England Biolabs Inc.M0491S GeneJet Genomic DNA PurifififcationKit Thermo ScientificK0721ل 50 rxnإنزيمات التقييد والمخزن المؤقت (NcoI ، XhoI) شركة نيو إنجلاند بيولابز إنك.R3193S / R0146S Wizard SV Gel and PCR Clean-Up KitPromegaA9282ل 250 rxnMonarch DNA Gel Extraction Kit New England Biolabs Inc.#T1020Sل 50 rxnGeneJet Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0503ل 250 rxnGoTaq G2 DNA PolymerasePromegaM7841 24 بئر سوداء سنسوبليت مع قاع زجاجيGreiner Bio One662892 FLUOStar قارئ لوحة أوميغاBMG Labtech OPTIMA / تحليل المريخ برنامجBMG Labtech الإصدار 2.20Microsoft Excel 2010Microsoft Multitron Standard Incubator ShakerInfors AG