زراعة بكتيريا Magnetospirillum وتقييم سلوكها المغناطيسي

الملخص

المصدر: Le Nagard، L.، et al. تزايد البكتيريا المغناطيسية من جنس Magnetospirillum: سلالات MSR-1 و AMB-1 و MS-1. J. Vis. Exp. (2018).

يوضح هذا الفيديو كيفية استزراع بكتيريا Magnetospirillum في ظل الظروف الهوائية الدقيقة باستخدام كل من الوسائط السائلة وشبه الصلبة. يسلط الضوء على تكوين شريط بكتيري مرئي عند واجهة نقص الأكسجين وهجرته الصاعدة مع استنفاد الأكسجين. يوضح الفيديو أيضا كيفية تقييم السلوك المغناطيسي من خلال مراقبة السباحة الاتجاهية استجابة للمجال المغناطيسي.

البروتوكول

1. تلقيح البكتيريا المغناطيسية (MTB)

ملاحظة: يمكن الحصول على مزارع السلالات AMB-1 و MS-1 و MSR-1 تجاريا (جدول المواد).

تنبيه: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية في ظروف معقمة ، تحت لهب موقد بنسن.

1. تلقيح السلالات MSR-1 و AMB-1 و MS-1 في نمط سائل < ol = 'نوع نمط القائمة: عشري" ؛ >
2. ختم زجاجة مصل فارغة سعة 125 مل بسدادة مطاطية من البوتيل وختم تجعيد من الألومنيوم. أدخل إبرتين في الزجاجة من خلال السدادة ، وقم بتوصيل حقنة بأحدهما. قم بتوصيل المحقنة بأسطوانة O₂ من خلال نفس نوع الأنابيب المستخدمة في محطة N₂.
3. دع O₂ يتدفق عبر الزجاجة لمدة 30 دقيقة تقريبا لضمان استبدال كل الهواء الموجود في الزجاجة ب O₂. قم بإزالة كلتا الإبرتين ، مما يسمح بضغط زائد طفيف في الزجاجة ، ثم الأوتوكلاف. اترك الزجاجة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
   ملاحظة: لتوفير الوقت ، قم بتنفيذ الخطوتين 1.1.1 و 1.1.2 أثناء التحضير المتوسط وقم بتعقيم الزجاجة مع محاليل الوسط أو المرق.
قم
4. بتعقيم أسطح سدادات كل من الزجاجة المتوسطة الطازجة وزجاجة O₂ عن طريق وضع بضع قطرات من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ فوقها وتمريرها عبر لهب موقد بنسن.
5. باستخدام حقنة معقمة وإبرة ، استخرج 1 مل من O₂ من زجاجة O₂ وانقله إلى الزجاجة المتوسطة الطازجة. تأكد من أن الإبرة مناسبة بإحكام للحقنة أثناء هذه الخطوة لتجنب أي هواء في المحقنة.
6. إذا كنت تستخدم اللقاح من مزرعة أخرى نمت في زجاجة زجاجية ، فقم بتعقيم سدادات كل من الزجاجة المتوسطة الطازجة وزجاجة الثقافة القديمة عن طريق وضع بضع قطرات من محلول الإيثانول بنسبة 70٪ فوقها وتمريرها عبر لهب موقد بنسن. إذا كنت تستخدم اللقاح من أنبوب من الثقافة المجمدة ، فما عليك سوى تركه يسخن إلى درجة حرارة الغرفة مع إغلاق الأنبوب تحت لهب موقد بنسن.
7. في حالة استخدام اللقاح من مزرعة أخرى تزرع في زجاجة زجاجية ، قم بتلقيح 1 مل من المزرعة القديمة في الوسط الطازج. في حالة استخدام اللقاح من مخزون مجمد ، قم بتلقيح 0.1 مل فقط لتخفيف الجلسرين أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) المستخدم في عملية التجميد. في كلتا الحالتين ، استخدم إبرة معقمة وحقنة معقمة.
8. احتضان المزرعة عند 32 درجة مئوية وتلقيحها في وسط جديد بعد 4 إلى 7 أيام.

تلقيح MSR-1 في وسط شبه صلب متدرج O₂

1. تحقق من أن أنبوب الوسط الجديد يعرض واجهة أكسجة منخفضة الأكسجين محددة جيدا (OAI) ، تتحقق من خلال واجهة وردية إلى عديمة اللون.
2. إذا كان اللقاح قادما من مزرعة شبه صلبة أخرى متدرجة تركيز O₂ ، فقم بحصاد البكتيريا عن طريق سحب 50 ميكرولتر من المزرعة بطرف ماصة معقم يوضع على النطاق الذي تتكون منه البكتيريا. تلقيح هذه البكتيريا ببطء في OAI في الوسط الطازج (الواجهة الوردية/عديمة اللون), تجنب إزعاج الواجهة. إذا كان اللقاح قادما من مزرعة مجمدة ، فتابع بنفس الطريقة مع 100 ميكرولتر من اللقاح بدلا من ذلك.
3. أغلق الأنبوب واترك البكتيريا تنمو بين 25 درجة مئوية و 30 درجة مئوية. انقله إلى وسط جديد باستخدام نفس الإجراء قبل أن يصل شريط البكتيريا إلى سطح الوسط.

2. مراقبة البكتيريا

1. : قم بتعقيم سدادة زجاجة الثقافة عن طريق وضع محلول الإيثانول بنسبة 70٪ فوقها وتمريرها عبر لهب موقد بنسن. للحصول على وسط شبه صلب ، افتح الأنبوب تحت لهب موقد بنسن. استخدم إبرة معقمة وحقنة معقمة لاستخراج البكتيريا.
2. استخدم طريقة السقوط المعلق 8 للتأكد من أن البكتيريا مغناطيسية ومتحركة.
   ملاحظة: يعطي الفحص المجهري لتباين الطور نتائج رائعة ، ولكنه ليس إلزاميا. التكبير الذي يتراوح من 10X إلى 60X مناسب.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' >< فئة الجدول = 'ck-table-ressize'>قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AMB-1 American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 700264 MS-1ATCCATCC 31632 MSR-1Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) DSM 6361L-cysteine.HCl.H₂OSigma-AldrichC7880-100G 1.0 مل محاقنFischer ScientificB309659 25G x 1 إبرBD305125 125 ملWheaton223748 20 مم أختام الألومنيومWheaton224223-01 20 مم EZ المكشكشويتونW225303 سدادات مطاطيةمن البوتيل Bellco Glass، Inc.2048-11800 أنابيب HungateChemglass (VWR) CLS-4208-01 سدادة الحاجز ، 13 مم ، HungateBellco Glass، Inc.2047-11600 أنابيب ثقافة الزجاجCorning (VWR) 9826-16X