طريقة التخفيف الدقيق للمرق لاختبار حساسية المضادات الحيوية للبكتيريا موجبة الجرام

Abstract

المصدر: Koeth، L. M.، et al.، طريقة التخفيف الدقيق للمرق المرجعي لاختبار الحساسية في المختبر للبكتيريا التي تنمو هوائيا. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو طريقة التخفيف الدقيق للمرق لتحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) لمضاد حيوي ليبوغليكوببتيد ضد البكتيريا موجبة الجرام. وهو يغطي عزل المستعمرة البكتيرية ، والتخفيف ، وتلقيح آبار الصفيحة الدقيقة بتركيزات متفاوتة من المضادات الحيوية ، والتحقق من نقاء الثقافة وعدد الخلايا. يشرح الفيديو أيضا كيف يعطل ارتباط المضادات الحيوية تخليق جدار الخلية ، مما يؤدي إلى التحلل ، وكيفية تحديد MIC بناء على تثبيط النمو المرئي.

Protocol

1. تحضير تخفيفات لوحة الميكروفون

1. قم بإعداد محلول مخزون لا يزيد عن 1,600 ميكروغرام / مل من دالبافانسين في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أنيق (نقي) في زجاج معقم أو أنابيب بلاستيكية ، واستخدمه في نفس يوم التحضير أو تخزينه في درجة حرارة -20 إلى -60 درجة مئوية أو أقل للاستخدام في المستقبل في مجمد غير قابل لإزالة الجليد. ضع في اعتبارك فاعلية دالبافانسين كما هو موضح في الوثائق المستلمة مع المسحوق عند وزن المسحوق.
2. قم بتخفيف المخزون بشكل مشابه للمخطط باستخدام DMSO أنيق في أنابيب زجاجية أو بلاستيكية معقمة. استخدم ماصة واحدة لقياس المخفف وماصة أخرى لإضافة مخزون دالبافانسين الأولي إلى الأنبوب الأول. لكل تركيز لاحق لمخزون دالبافانسين ، استخدم ماصة جديدة.
3. قم بإعداد 100X تخفيفات تركيز لوحة MIC النهائية (تركيزات متوسطة) باستخدام DMSO أنيق. اجمع بين الأحجام المناسبة من المصدر و DMSO لتحقيق التركيز الوسيط المطلوب (ستعتمد الأحجام التي سيتم استخدامها على عدد لوحات MIC المراد تصنيعها).
4. تحضير 0.004٪ P80: قم بإعداد محلول مخزون عمل طازج بنسبة 2٪ P80 عن طريق إضافة 0.1 مل P80 إلى 4.9 مل dH₂O. قم بالتعقيم بالمرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر واستخدم المحلول في نفس يوم التحضير. قم بإعداد مخفف P80 بنسبة 0.004٪ عن طريق عمل تخفيف بنسبة 1: 500 بنسبة 2٪ P80 (على سبيل المثال ، 0.3 مل من 2٪ P80 إلى 149.7 مل من CAMHB).
5. علاوة على ذلك ، قم بتخفيف التركيزات المتوسطة 1: 100 في مرق مولر هينتون المعدل بالكاتيون (CAMHB) المكمل ب 0.004٪ (v / v) polysorbate-80 (P-80) و / أو LHB (للمكورات العقدية) المضافة بضعف التركيز النهائي لأن إضافة اللقاح سيؤدي إلى تخفيف 1: 2.

2. تحضير لوحات الميكروفون

1. توزيع 50 ميكرولتر من كل محلول دالبافانسين المحضر في الآبار المناسبة للوحة الميكروفون وقم بتضمين الوسائط في بئر واحد فقط (بئر التحكم في النمو). يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات ذات أطراف معقمة لهذه الخطوة.
2. استخدم الألواح على الفور أو أغلقها بغشاء بلاستيكي ، وضعها في أكياس بلاستيكية ، وضعها على الفور في فريزر غير قابل للإذابة عند ≤ -20 درجة مئوية (يفضل أن تكون عند ≤ -60 درجة مئوية) لحين الحاجة. إذا تم استخدام الألواح المجمدة ، فقم بإزالة الأختام وضع الألواح الفردية على مقعد المختبر لمدة 15-30 دقيقة (حتى تذوب محتويات البئر) قبل الشروع في تلقيح اللوحة.

3. تلقيح لوحات الميكروفون ، وأداء النقاء ، وإعداد عدد المستعمرات حدد

1. العديد من المستعمرات المعزولة جيدا من أجار الدم لمدة 18-24 ساعة أو غيرها من لوحة أجار غير الانتقائية. المس الجزء العلوي من كل مستعمرة بحلقة معقمة أو مسحة وانقلها إلى 1-5 مل CAMHB أو محلول ملحي حتى تصبح التعكر مكافئة لمعيار 0.5 McFarland. قم بتقييم التعكر من خلال المقارنة المرئية مع 0.5 ماكفارلاند أو باستخدام جهاز ضوئي.
2. في غضون 15-30 دقيقة من التحضير ، قم بتخفيف اللقاح 1: 100 في CAMHB (100 ميكرولتر إلى 10 مل CAMHB). بالنسبة لمعظم البكتيريا التي تم اختبارها ضد دالبافانسين ، باستثناء S. pneumoniae ، سيوفر هذا التخفيف تركيزا نهائيا للبئر يبلغ 5 × 10⁵ CFU / مل (النطاق المقبول هو 2-8 × 10 CFU / مل). بالنسبة إلى S. pneumoniae ، عادة ما يكون تركيز البكتيريا بناء على مقارنة التعكر ب 0.5 McFarland أقل بكثير. لذلك ، قم بتخفيف اللقاح 1:25 (400 ميكرولتر إلى 10 مل CAMHB + 10٪ LHB).
3. في غضون 15 دقيقة بعد تحضير اللقاح ، انقل 50 ميكرولتر من اللقاح النهائي إلى كل بئر (باستثناء بئر التحكم في العقم) من لوحة MIC المحضرة. يمكن استخدام ماصة متعددة القنوات باستخدام أطراف معقمة لهذه الخطوة.
4. قم بإجراء فحص نقاء عن طريق نقل ونشر 1-10 ميكرولتر من بئر التحكم في النمو الإيجابي باستخدام حلقة معقمة إلى أجار غير انتقائي (على سبيل المثال ، أجار الصويا التربتيكاز مع 5٪ من دم الأغنام).
5. قم بإعداد عدد المستعمرات عن طريق إزالة 10 ميكرولتر من بئر التحكم في النمو باستخدام ماصة أحادية القناة وطرف معقم ونقلها إلى 10 مل من المحلول الملحي (تخفيف 1: 1,000). امزج وانقل 100 ميكرولتر باستخدام ماصة أحادية القناة وطرف معقم إلى وسط أجار مناسب غير انتقائي (على سبيل المثال ، أجار الصويا التربتيكاز مع 5٪ من دم الأغنام) وانتشر على سطح الأجار بالكامل بحلقة معقمة ، وكرر مرتين في اتجاهات مختلفة لضمان التوزيع المتساوي لللقاح (تخفيف 1:10).

4. احتضان لوحات الميكروفون ، وعدد المستعمرات ، ولوحات النقاء

1. ختم كل لوحة ميكروفون أو كومة لا تزيد عن أربع ألواح في كيس بلاستيكي بشريط بلاستيكي أو بغطاء بلاستيكي محكم قبل الحضانة. بدلا من ذلك ، ضع لوحة MIC فارغة في الجزء العلوي من المكدس الذي لا يزيد عن 4 لوحات MIC ، ضع منشفة ورقية مبللة في حاوية بلاستيكية ، ضع ألواح MIC في الحاوية البلاستيكية ، وأغلق الحاوية بإحكام بغطاء. احتضان ألواح الميكروفون في حاضنة الهواء المحيط عند 35 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة (المكورات العنقودية والمكورات المعوية) و 20-24 ساعة (المكورات العقدية) في غضون 30 دقيقة من التلقيح. احتضان عدد المستعمرات وألواح النقاء في ظل نفس الظروف ، باستثناء احتضان المكورات العقدية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.

5. قراءة لوحات MIC و Colony Count ؛ تحقق من لوحة النقاء

1. اقرأ الميكروفون على أنه أقل تركيز يمنع تماما نمو البكتيريا في الآبار كما تكتشفه العين المجردة.
2. عد المستعمرات على لوحة عد المستعمرة. اضرب كل مستعمرة في عامل التخفيف (1: 10،000) (على سبيل المثال ، 50 مستعمرة تعادل 5 × 10 CFU / مل). النطاق المقبول هو 20-80 مستعمرة (2-8 × 10 CFU / مل) ويستخدم كمبدأ توجيهي تقريبي.
3. تحقق من لوحة النقاء. إذا كانت جميع المستعمرات متشابهة مع كل مستعمرة ، فيمكن اعتبار اللقاح نقيا. إذا كانت هناك أي مستعمرات أخرى موجودة ، فهناك احتمال وجود ملوث في لوحة MIC ، ويجب تكرار الاختبار.

Materials