مقالة منهجية

التصور بوساطة الجسيمات النانوية لإعادة تشكيل الليزوزومات الداخلية في الخلايا المصابة بالبكتيريا

أغسطس 29, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Zhang، Y.، et al. تطبيق الجسيمات النانوية الفلورية لدراسة إعادة تشكيل النظام التحلي الداخلي بواسطة البكتيريا داخل الخلايا. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو استخدام الجسيمات النانوية الفلورية لتصور إعادة تشكيل الأحزمات الليزوزومية الداخلية في الخلايا الظهارية البشرية المصابة بالبكتيريا داخل الخلايا. بعد الغزو البكتيري ، تتلاعب مسببات الأمراض بالهيكل الخلوي المضيف والنظام الليزوزومي الداخلي ، وتشكل فجوات ذات نتوءات أنبوبية تغير نقل الحويصلة. ثم يتم استخدام الجسيمات النانوية ذات العلامات الفلورية لتتبع هذه التغييرات ، مما يسمح بتصوير عالي الدقة لأحداث الاتجار داخل الخلايا التي يسببها مسببات الأمراض.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ثقافة خلايا HeLa
    1. خلايا HeLa التي تعبر بشكل دائم عن LAMP1-GFP (بروتين سكري غشائي مرتبط بالليزوسوم 1-بروتين فلوري أخضر) يتم استزراعها في وسط النسر المعدل من Dulbecco ، أو DMEM مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ (FCS) وتنمو عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    2. قم بزرع الخلايا بكثافة 50,000 لكل بئر في شريحة غرفة مكونة من 8 آبار (Ibidi) واحتضانها بين عشية وضحاها (O / N).
  2. ثقافة البكتيريا
    1. استخدم سلالة السالمونيلا المعوية المصلية Typhimurium NCTC 12023 من النوع البري (WT). للمقارنة ، استخدم السلالات الطافرة ΔssaV المعيبة في SPI2-T3SS و ΔsifA التي تفتقر إلى المستجيب الرئيسي SifA ل SIF. استخدم السلالات التي تحتوي على البلازميد pFPV25.1 للتعبير التأسيسي عن GFP المحسن.
      ملاحظة: يتم استزراع السلالات البكتيرية بشكل روتيني في مرق Luria-Bertani (LB) مع إضافة 50 ميكروغرام / مل من الكاربينيسيلين (WT) و LB مع إضافة 50 ميكروغرام / مل من الكاربينيسيلين و / أو 50 ميكروغرام / مل كاناميسين (ΔssaV ، ΔsifA) المطلوبة للحفاظ على البلازميدات.
    2. تلقيح مستعمرة واحدة من البكتيريا في 3 مل رطل بالمضادات الحيوية المناسبة وقم بزراعة O / N عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف اهتزاز للتهوية ، ثم قم بتخفيف 1:31 في LB الطازج واستمر في النمو لمدة 3.5 ساعة. في هذه المرحلة الزمنية ، تصل الثقافات إلى مرحلة السجل المتأخرة وتكون البكتيريا شديدة التوغل. تعتبر "الأسطوانة الأسطوانة" ملائمة لاحتضان مزارع أنبوب الاختبار مع التهوية.
  3. إصابة خلايا HeLa بالسالمونيلا وجسيمات النانو الذهبية-BSA-Rhodamine أو NPs Pulse Chase-labeling (انظر الشكل 1 للحصول على المخطط)
    1. قياس OD600 من البكتيريا المزروعة الفرعية وتخفيفها إلى OD600 = 0.2 في 1 مل محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS (~ 3 × 108 CFU / ml) ، أضف كميات مناسبة من البكتيريا إلى خلايا HeLa في شرائح غرفة مكونة من 8 آبار لتحقيق تعدد العدوى (MOI) من 100.
    2. احتضن لمدة 30 دقيقة في حاضنة الخلية ، واغسلها 3 مرات باستخدام PBS لإزالة البكتيريا غير الداخلية (تم تعيين هذه النقطة الزمنية على أنها 0 ساعة بعد الإصابة ، أو 0 ساعة في البوصة). أضف 300 ميكرولتر من وسط الاستزراع الطازج الذي يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين واحتفظ به لمدة 1 ساعة. ثم استبدل الوسط بوسط طازج يحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين لبقية وقت الحضانة.
    3. بعد الحضانة بوسط استزراع يحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين لمدة ساعة واحدة ، يتم استبدال الوسط بوسيط تصوير (Eagle's MEM بدون FCS ، L-glutamine ، الفينول الأحمر ، وبيكربونات الصوديوم ، مع 30 ملي مولار HEPES ، درجة الحموضة 7.4) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين. تضاف Gold-BSA-rhodamine NPs إلى خلايا HeLa للحصول على تركيز نهائي من OD520 = 0.1. (ألبومين مصل البقر ، أو BSA)
      ملاحظة: يمكن أيضا إضافة Gold-BSA-rhodamine NPs إلى الخلايا قبل الإصابة ، أو في نقاط زمنية مختلفة في البوصة.
    4. بعد 1 ساعة من الحضانة ، قم بإزالة الوسط ، واغسله 3 مرات باستخدام PBS ، وأضف 300 ميكرولتر من وسط التصوير الطازج الذي يحتوي على 10٪ FCS و 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين لبقية وقت الحضانة.
      ملاحظة: قد تختلف مدة الحضانة اعتمادا على تركيز NPs وخطوط الخلايا المستخدمة. بالنسبة للضامة RAW264.7 ، لاحظنا أن الحضانة لمدة 30 دقيقة مع NPs بتركيز OD520 = 0.05 سمحت باستيعاب كاف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فئة الشكل = 'الصورة image_resized image-style-align-center' style='display:table;margin-left:auto;margin-right:auto;width:75٪;'>figure-results-1

الشكل 1. مخطط لإعداد خلايا HeLa لتصوير الخلايا الحية. تم زرع خلايا HeLa في شرائح الغرفة ، أو مصابة بعدوى وهمية ، أو مصابة بسلالات مختلفة من السالمونيلا لمدة 30 دقيقة ، وغسلها 3 مرات باستخدام PBS ، ثم تحضنها بوسط يحتوي على 100 ميكروغرام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

< فئة الشكل = 'الجدول' ><فئة الجدول = 'ck-table-resize'> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الذهبسيجما ألدريتش520918 ألبومين مصل الأبقارSigmaA2153 NHS-RhodaminePierce46406 DMSOSigmaD8418 HEPESSigmaH3375 GentamicinApplichemA1492 KanamcyinRothT832 CarbenicillinRoth6344 شرائح غرفة 8 آبارIbidi80826زراعة الأنسجة المعالجة ، معقمة

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة