زراعة المتفطرة السلية في ظل ظروف محدودة الحديد

الملخص

المصدر: Gupta, S., et al. عزل وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها البكتيريا الفطرية محدودة الحديد. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو إجراء زراعة المتفطرة السلية في ظل ظروف محدودة الحديد للحث على إجهاد الحديد وتعزيز إفراز السيدروفورات التي تدعم بقاء البكتيريا.

البروتوكول

1. زراعة البكتيريا الفطرية في ظروف محدودة الحديد

1. قم بإذابة 50 ميكرولتر من مخزون الجلسرين المجمد بنسبة 15٪ من Mtb (المتفطرة السلية) وقم بتشكيل صفيحة أجار مكملة بتخصيب ADN بنسبة 10٪ (الألبومين - سكر العنب - كلوريد الصوديوم) (5 جم / لتر ألبومين ، 2 جم / لتر سكر العنب ، و 0.85 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، 0.2٪ جلسرين ، و 0.05٪ توين -80). احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات.
2. تلقيح مستعمرة واحدة من Mtb في 2 مل من وسط مرق البكتيريا الفطرية (جدول المواد) مع تكميل إثراء ADN. احتضان مع التحريض عند 37 درجة مئوية.
3. دع ثقافة Mtb تنمو إلى المرحلة اللوغاريتمية المتأخرة (OD₅₄₀ هو ~ 0.8). للتحقق من ذلك ، قم بقياس OD₅₄₀ باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
4. انشر 200 ميكرولتر من الثقافة اللوغاريتمية المتأخرة على ألواح أجار الفطرية (جدول المواد) مكملة بنسبة 0.2٪ جلسرين و 0.05٪ توين -80 و ADN. تلقيح 5 أطباق على الأقل. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية حتى يظهر نمو البكتيريا كطبقة متقاربة. يستغرق هذا ~ 1 أسبوع ل Mtb.
5. بلل قطعة قطن معقمة في LIMM (متوسطة منخفضة الحديد استخدم هذه المسحة لجمع البكتيريا من ألواح الأجار وتطعيم 100 مل من LIMM لتحضير معلق بكتيري مركز باستخدام OD₅₄₀ من ~ 1.0.
6. قم بتخفيف هذا المعلق 10 مرات إلى 1 لتر باستخدام LIMM وقسمه إلى زجاجتين بلاستيكيتين معقمين سعة 2 لتر ، تحتوي كل منهما على 500 مل من المزرعة.
7. أخرج 2 مل من المزرعة وانقلها إلى أنبوب مزرعة سعة 5 مل. أضف 10 ميكرولتر من 10٪ فول / فول تايلوكسابول.
8. احتضان الثقافات عند 37 درجة مئوية لمدة 14 يوما.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ميدلبروك 7H10 أجار	بي دي ديفكو	262710	لوحات أجار الفطرية
مرق ميدلبروك 7H9	بي دي ديفكو	271310	وسط مرق الفطرة
أنبوب طرد مركزي رقيق الجدران من مادة البولي بروبيلين 13x15 مم	بيكمان كولتر	344059	أنبوب طرد مركزي رقيق الجدران من مادة البولي بروبيلين 13x15 مم
قوارير الترشيح الفراغية	سيلبرو	الإصدار 50022	وحدة التصفية