$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. مجموعة من الحويصلات خارج الخلية الفطرية (MEVs)
- قم بقياسOD 540 من مزرعة 2 مل في وقت التجميع. قم بعمل تخفيفات تسلسلية بنسبة 1:10 للثقافة والصفيحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف على ألواح أجار مع ADN و 0.05٪ Tween-80.
- انقل المزرعة إلى خمسة أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 225 مل وأجهزة طرد مركزي عند 2,850 × جم لمدة 7 دقائق عند 20 درجة مئوية.
- اجمع المادة الطافية المزرعة باستخدام ماصة سعة 50 مل وقم بتعقيمها بالفلتر من خلال وحدة مرشح 0.22 ميكرومتر.
2. عزل المركبات الكهربائية والمتوسطة
- انقل مرشح المزرعة إلى نظام الترشيح الفائق للخلية المقلوبة عند 4 درجات مئوية وقم بتصفية التركيز عند <50 رطل لكل بوصة مربعة من خلال غشاء قطع 100 كيلو دالتون إلى ~ 50 مل.
- قم بالطرد المركزي لمرشح المزرعة المركزة عند 15,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية واجمع المادة الطافية.
- جهاز طرد مركزي ، ترشيح المزرعة في أنابيب الطرد المركزي الفائق المصنوعة من البولي كربونات عند 100،000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الكريات الغشائية بإجمالي 1 مل من المحلول الملحي المعقم المخزن بالفوسفات (PBS) عن طريق سحب العينات اللطيف.
- امزج 0.5 مل من معلق الحبيبات الذي تم الحصول عليه في الخطوة 2.4 مع 1.5 مل من محلول اليوديكسانول 60٪ ، مما ينتج عنه تركيز نهائي من اليوديكسانول بنسبة 45٪ بالوزن / الحجم. قم بتوزيع هذا المزيج في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق الجدران الرقيق من البولي بروبيلين مقاس 13 مم × 51 مم.
- تراكب معلق MEV-iodixanol بنسبة 45٪ مع 1 مل من محاليل يوديكسانول 40٪ و 35٪ و 30٪ و 25٪ و 20٪ (حجم / حجم في PBS) و 1 مل من PBS في الأعلى.
- جهاز طرد مركزي عند 100,000 × جم لمدة 18 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- اجمع كسور التدرج الكثافة 1 مل بدءا من الأعلى باستخدام حقنة هاميلتون سعة 1 مل.
- قم بتخفيف كل جزء تم جمعه إلى 20 مل باستخدام PBS وجهاز طرد مركزي عند 100,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة المادة الطافية الحبيبات في 0.5 مل من PBS. قم بتخزين هذه الحبيبات عند 4 درجة مئوية.