$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. السلالات البكتيرية وظروف الزراعة
ملاحظه: السلالات البكتيرية المستخدمة في هذه الدراسة هي الإشريكية القولونية MP1 ، Akkermansia mucinophila ، Bacteroides thetaiotaomicron ، Bifidobacterium breve ، و Bifidobacterium dentium.
1. بالنسبة للإشريكية القولونية ، استخدم حلقة معقمة لتلقيح مستعمرات مفردة في 250 إلى 1,000 مل من مرق Luria-Bertani (LB) واحتضان هوائية في حاضنة اهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة قبل معالجة الثقافة. بالنسبة للسلالة المؤتلفة بكتريا قولونية MP1 التي تحتوي على p114-mCherryClyluc ، أضف الكلورامفينيكول إلى أجار LB والمرق بتركيز نهائي يبلغ 17 ميكروغرام / مل.
2. بالنسبة إلى A. mucinophila و B. thetaiotaomicron و B. breve و B. dentium ، خط على ألواح أجار ضخ قلب الدماغ (BHI) واحتضان اللاهوائي داخل غرفة الفينيل اللاهوائية. تلقيح مستعمرات مفردة في 100 مل من مرق BHI المخفضة مسبقا واحتضان لمدة 48 ساعة لاهوائية.
2. عزل EV
1. توضيح وسط الاستزراع البكتيري عن طريق الطرد المركزي والترشيح
1. انقل مزارع الخلايا البكتيرية الملقحة في الخطوة 1 لتنظيف زجاجات الطرد المركزي المصنوعة من مادة البولي بروبلين سعة 250 مل أو 500 مل عن طريق الصب. قم بالطرد المركزي للزجاجات في دوار بسعة كبيرة وثابتة الزاوية عند 4 درجات مئوية و 5,000 × جم لمدة 15 دقيقة. انقل المادة الطافية لتنظيف زجاجات أجهزة الطرد المركزي عن طريق الصب الدقيق ، وقم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 10,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
ملاحظه: أعد استخدام الزجاجات بعد التنظيف وإزالة التلوث المناسبة للسلامة البيولوجية.
1. في حالة وجود كريات كبيرة من الخلايا البكتيرية بعد الطرد المركزي الثاني ، كرر الطرد المركزي في زجاجة نظيفة لإزالة الخلايا بشكل أكبر.
2. انقل المادة الطافية إلى جهاز مرشح يعمل بالفراغ بولي إيثر سلفون بحجم مناسب بحجم مناسب عن طريق الصب. قم بالتصفية عن طريق توصيل جهاز الترشيح بمصدر جدار فراغ. إذا انخفض معدل الترشيح بشكل كبير ، فما عليك سوى نقل أي مادة غير مفلترة إلى جهاز جديد. قم بتخزين الوسط المصفى عند 4 درجات مئوية طوال الليل واستمر في البروتوكول في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك.
ملاحظه: تسمح أجهزة الطرد المركزي أعلاه عادة بمعالجة ~ 2x الحجم المشار إليه لزراعة الخلايا من خلال كل جهاز. على سبيل المثال ، يمكن لجهاز مرشح واحد سعة 500 مل تصفية ~ 1,000 مل من ثقافة الطرد المركزي. لا يتم إعادة استخدام هذه الأجهزة عادة. لا ينصح باستخدام مرشحات المحاقن في هذه الخطوة دون تحسين ، حيث لوحظت خسائر كبيرة مع النماذج المختبرة. هذه نقطة توقف محتملة.
3. تحقق من الإزالة الكاملة للخلايا القابلة للحياة في هذه المرحلة عن طريق نشر كمية من المادة الطافية المفلترة على ألواح أجار مناسبة وتأكد من عدم وجود أي مستعمرات بعد الحضانة في الظروف المثلى للسلالة البكتيرية. إذا تم اكتشاف البكتيريا ، فقم بتحسين الإجراء أعلاه عن طريق إجراء عمليات طرد مركزي و / أو ترشيح إضافية.
2. تركيز الوسط المصفى
1. إذا كنت تعمل بأحجام >100 مل بشكل كبير ، فانتقل إلى الخطوة 2.2.2. إذا كنت تعمل بأحجام ~ 100 مل ، فقم بتحميل 90 مل من وسط الاستزراع المفلتر على الخزان بسعة 100 كيلو دالتون جهاز الترشيح الفائق للطرد المركزي باستخدام الماصات المصلية. قم دائما بالتوازن مع جهاز الترشيح الفائق المطابق، وجهاز الطرد المركزي في دوار دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية و 2,000 × جم لمدة 15-30 دقيقة، حتى يتركز حجم الوسط في الخزان العلوي إلى <0.5 مل.
1. قم بتعبئة الخزان بأي وسيط ثقافة مفلتر متبقي. في حالة "التعبئة ، قم بإزالة التدفق في الجزء السفلي من الجهاز وأعد موازنة أي أجهزة.
ملاحظه: لوحظ أن الحد الأقصى لحجم وسط الاستزراع المفلتر الذي يمكن تركيزه باستخدام هذه الأجهزة هو <2 ضعف الحجم الموصى به.
2. إذا زادت لزوجة الوسط المركز في الخزان بشكل واضح (مادة داكنة ولزجة) ، فقم بتخفيفها بالمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) وإعادة التركيز عن طريق الطرد المركزي لتخفيف أي بروتينات غير EV أصغر من MWCO البالغة 100 كيلو دالتون.
ملاحظه: هذه نقطة توقف محتملة.
3. انقل الوسط المركز إلى أنبوب منخفض ربط البروتين ، وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية طوال الليل ، واستمر في البروتوكول في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك.
2. إذا كنت تعمل بأحجام >100 مل بشكل كبير ، فحدد جهاز ترشيح التدفق العرضي (TFF) بحجم مناسب (100 كيلو دالتون MWCO) لاستيعاب الحجم المراد معالجته.
ملاحظه: تتوفر أجهزة الترشيح لمعالجة 100 مل إلى >1,000 مل تجاريا. سيحدد التوافر المحلي والتكلفة والتوافق مع المضخة والأنابيب / التوصيلات النماذج المعينة التي ستكون أكثر فائدة. تمت معالجة ما يصل إلى 2 لتر من وسط الاستزراع باستخدام الجهاز المشار إليه في جدول المواد قبل الحاجة إلى تنظيف الفلتر (انظر الخطوة 2.3 أدناه للحصول على بروتوكول التنظيف).
1. قم بتجميع دائرة ترشيح مع أنابيب # 16 منخفضة الربط / منخفضة الترشيح ، ومحولات خرطوم 1/8 بوصة إلى محولات Luer ، وجهاز TFF ، ومضخة تمعجية.
ملاحظه: قم بإجراء TFF داخل خزانة السلامة الحيوية لتقليل مخاطر تلويث مستحضر المركبات الكهربائية بالبكتيريا البيئية.
2. في درجة حرارة الغرفة ، ابدأ في تدوير الوسط المصفى والمكيف بحوالي 200 مل / دقيقة (100 مل / دقيقة كحد أدنى). حدد عدد الدورات في الدقيقة المناسب المقابل لمعدل التدفق المطلوب عن طريق ضخ 200 مل من PBS في وعاء متدرج. عند تعميم الوسط المشروط المصفى ، اجمع الجزيئات <100 كيلو دالتون التي تعبر غشاء الترشيح الفائق كنفايات في وعاء منفصل.
ملاحظه: سيفترض المثال أدناه حجم بدء 2 لتر من الثقافة.
3. استمر في تعميم الوسط المكيف حتى يتم تقليل حجمه إلى ~ 100-200 مل. انتقل إلى أوعية أصغر حسب الحاجة. خفف 2 أضعاف مع PBS ، واستمر في الدوران مع المضخة ، مع التركيز حتى 75-100 مل. خفف 2 أضعاف مع PBS واستمر في الدوران إلى الحجم النهائي 25 مل. خفف 2 أضعاف مع PBS واستمر في الدوران حتى <10 مل.
4. ارفع أنبوب التغذية من خزان العينة واستمر في الضخ لتطهير المرشح واستعادة أكبر قدر ممكن من العينة.
ملاحظه: هذه نقطة توقف محتملة.
5. انقل العينة المركزة إلى أنبوب مخروطي وقم بتخزينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية إذا رغبت في ذلك. بدلا من ذلك ، استمر في البروتوكول.
6. انقل العينة المركزة إلى جهاز الترشيح الفائق بالطرد المركزي بسعة 15 مل 100 كيلو دالتون MWCO. جهاز طرد مركزي في دوار دلو متأرجح عند 4 درجات مئوية و 2,000 × جم لمدة 15-30 دقيقة حتى يتركز حجم الوسط في الخزان العلوي إلى <2 مل.
ملاحظه: هذه نقطة توقف محتملة.
7. انقل الوسط المركز إلى أنبوب منخفض الربط بالبروتين ، واحفظه في درجة حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل ، مع الاستمرار في البروتوكول في اليوم التالي إذا رغبت في ذلك.