$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC)
ملاحظه: يستخدم SEC لزيادة نقاء الحويصلات خارج الخلية (EVs) وإزالة البروتين غير الحويصلي.
- استخدم عمود SEC صغير (حجم سرير 10 مل) لعزل المركبات الكهربائية عن <100 مل من مواد البداية وعمودا أكبر (حجم سرير 47 مل) لعزل المركبات الكهربائية عن >100 مل من مواد البدء.
ملاحظه: سيسرد المثال أدناه وحدات تخزين العمود الأكبر ، مع وحدات تخزين للعمود الأصغر بين قوسين. - قم بإحضار عمود SEC والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) إلى درجة حرارة الغرفة على مدار عدة ساعات. قم بتثبيت عمود SEC في وضع رأسي باستخدام حامل وحامل مختبر قياسي. بدلا من ذلك ، استخدم حوامل أعمدة الكروماتوغرافيا التجارية.
- قبل الاتصال بعمود SEC ، قم بترطيب خزان العينة عن طريق السماح ل 5 مل من PBS بالتدفق عبر فريت إلى حاوية النفايات. قم بفك غطاء مدخل عمود SEC ، وأضف 2 مل من PBS إلى خزان العينة ، وقم بتوصيل الخزان بعناية بالعمود حيث يتساقط PBS من خلال فريت (لا ينطبق على أعمدة SEC الصغيرة). ملاحظه: تمنع هذه الخطوة السابقة أي فقاعات هواء من الوقوع في الجزء العلوي من عمود SEC. إذا كان الهواء محاصرا ، فقم بإزالة الخزان ، وانقر فوق العمود لإخراج فقاعة الهواء ، وكرر إجراء التوصيل. بالنسبة للعمود الأصغر ، ما عليك سوى إلغاء الغطاء العلوي لعمود SEC ، وإرفاق قادوس العينة.
- أضف 47 مل (10 مل) من PBS إلى خزان العينة وفك الغطاء السفلي من عمود SEC. اسمح لجميع المخزن المؤقت للعينة المحملة بالتدفق عبر العمود للتوازن. تجاهل التدفق.
- قم بتحميل 2 مل (0.5 مل) كحد أقصى من العينة على خزان العينة ، وتخلص من التدفق ، واسمح للعينة بدخول العمود تماما.
- أضف PBS على الفور إلى خزان العينة أو القادوس بحجم 14.25 مل مطروحا منه حجم العينة (3 مل مطروحا منه حجم العينة ، للعمود الصغير). اسمح للمحلول بالتدفق عبر العمود وتجاهل هذا المبلغ الذي يساوي حجم فراغ العمود.
ملاحظه: بالنسبة لعينة نموذجية سعة 2 مل ، فإن كمية PBS التي ستتم إضافتها إلى خزان العينة أو القادوس ستكون 12.25 مل. - ضع أنبوبا دقيقا منخفض الارتباط سعة 2 مل أسفل عمود SEC مباشرة. أضف على الفور 2 مل (0.5 مل) من PBS إلى خزان العينة واسمح له بالدخول إلى العمود. قم بتسمية أول 2 مل (0.5 مل) من التدفق على أنه الكسر 1. استمر في إضافة 2 مل (0.5 مل) في المرة الواحدة إلى خزان العينة لتجميع كل جزء لاحق.
ملاحظه: معظم المركبات الكهربائية البكتيرية تتسرب في أول 5 كسور. أثناء التحسين ، تم جمع أول 12 كسورا. - قم بتخزين الكسور في درجة حرارة 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (أيام) أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.