العدوى البكتيرية في المختبر للخلايا التائية عن طريق تكوين المشبك المناعي

الملخص

المصدر: Cruz-Adalia, A., et al. تلتقط الخلايا التائية البكتيريا عن طريق نقل العدوى من الخلايا الشجرية. J. Vis. خبرة. (2016).

يوضح هذا الفيديو العدوى المتحولة للبكتيريا من خلال تفاعلات الخلايا التائية والخلايا المتغصنة الخاصة بالمستضد. يتم تحضين الخلايا المتغصنة المصابة بالبكتيريا التي تقدم ببتيد البيض الألبومين بالخلايا التائية ، إما مباشرة أو مفصولة بغشاء. يسمح الاتصال المباشر بتكوين المشبك المناعي ، مما يتيح نقل البكتيريا ، بينما يمنع الغشاء التفاعل. ثم يتم علاج الجنتاميسين للقضاء على البكتيريا خارج الخلية.

البروتوكول

ملحوظة: تم تربية الفئران في غلاف محدد خال من مسببات الأمراض (SPF) وتم القتل الرحيم لها من قبل موظفين مدربين ومؤهلين باستخدام طريقة استنشاق ثاني أكسيد الكربون (_{CO 2}).
1. تمايز الخلايا المتغصنة المشتقة من نخاع عظم الفأر (DCs) والعدوى ملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الأولى. يجب تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء المحرك من هذه النقطة فصاعدا ، باستخدام وسائط معقمة وأدوات وأطراف ماصة وأطباق ثقافة فقط.

1. تمايز DCs المشتقة من نخاع عظم الفأر
   1. قم بتشريح الظنبوب وعظم الفخذ من فأر C57 / BL6 ونقلهما إلى طبق بلاستيكي يحتوي على 10 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI).
   2. اقطع كل مشاشية ، بمقص معقم وفضح نخاع العظام ، الذي يتميز باللون الأحمر الفاتح المميز.
   3. انقع الجزء الداخلي من العظم ب 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) الذي يحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل البقر (BSA) و 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) (PBS / BSA / EDTA العازلة) باستخدام حقنة معقمة على طبق بتري معقم.
   4. اجمع تعليق الخلية وجهاز الطرد المركزي في أنبوب عند 600 × جم في جهاز طرد مركزي مبرد (4 درجات مئوية).
   5. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من محلول تحلل الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) (0.15 م كلوريد الأمونيوم (NH₄Cl) و 10 ملي بيكربونات البوتاسيوم (KHCO₃) و 0.1 ملي مولار EDTA) واحتضان لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة (RT) للتخلص من خلايا الدم الحمراء.
   6. أضف 10 مل من وسط RPMI 1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) وقم بالتصفية من خلال مصفاة خلوية (70 ميكرومتر) لإزالة شظايا العظام وكتل الخلايا قبل الطرد المركزي بنفس السرعة (600 × جرام) لأنه تم التخلص من الكتل عن طريق التصفية.
   7. عد الخلايا واضبطها إلى 5 × 10⁵ خلايا / مل مع RPMI 10٪ FBS (تحتوي على 50 ميكرومولار B-mercaptoethanol ، 1 ملي مولار بيروفات الصوديوم) وأضف 20 نانوغرام / مل عامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والضامة المؤتلفة (rm-GM-CSF) كتركيز نهائي.
   8. أضف هذا المعلق إلى معقم ، وجودة ميكروبيولوجية ، وطبق بتري 15 سم ، ومزرعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).
   9. كل ثلاثة أيام ، قم بتدوير كل من الخلايا غير الملتصقة والخلايا المنفصلة مع 5 ملي مولار EDTA في PBS وإعادة تعليقها عند 5 × 10⁵ خلايا / مل من كثافة الخلايا ، مع وسط جديد يحتوي على 20 نانوغرام / مل rm-GM-CSF.
2. نضوج التيار المستمر وتحميل المستضد
   1. في اليوم 9 ، أعد تعليق الخلايا بكثافة 5 × 10⁵ خلايا / مل في وسط يحتوي على 20 نانوغرام / مل rm-GM-CSF. بعد ذلك ، أضف 20 نانوغرام / مل من عديدات السكاريد الدهنية (LPS) للسماح بمركب التوافق النسيجي الرئيسي العالي أو تعبير معقد التوافق النسيجي الكبير العالي أو معقد التوافق النسيجي الكبير على الخلايا واحتضان في طبق بتري معقم 15 سم معالج بزراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة.
   2. بعد يوم واحد من تحفيز LPS ، قم بتلطيخ بعض خلايا DC بالأجسام المضادة ضد الفأر CD11c و MHC-II ومستقبلات الخلايا المحببة -1 أو Gr-1 للتحقق من تمايز DC عن طريق قياس التدفق الخلوي. يظهر مثال على تحليل قياس التدفق الخلوي للتيار المستمر في الشكلين 3 أ و 3 ب.
      1. احتضان التيار المستمر (5 × 10⁵ خلايا / عينة) مع جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر CD16 / CD32 عند 2.5 ميكروغرام / مل من التركيز النهائي في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA لكل عينة. بعد ذلك ، أضف 50 ميكرولتر من الأجسام المضادة ضد معقد التوافق النسيجي الكبير II (I-A / I-E) و CD11c و Gr-1 المقترنة بفلوروكرومات مختلفة عند 1: 100 و 1: 200 و 1: 500 في المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA ، على التوالي.
      2. أخيرا ، اغسل التيار المستمر باستخدام مخزن مؤقت PBS / BSA / EDTA وقم بتحليله عن طريق قياس التدفق الخلوي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
         ملاحظة: إذا كانت الخلايا متمايزة جيدا ، فهي جاهزة لتحميل المستضد.
   3. اغسل DCs باستخدام RPMI 10٪ FBS (بدون مضادات حيوية) واحتضانها ببتيد 10 ميكروغرام / مل OTII من البيضات البيض (OVAp) (OVA 323-339; I S Q A V H A A H A E I N E A G R) على أنبوب بلاستيكي في 1 مل من RPMI 10٪ FBS وسط لكل 5 × 10⁶ DCs لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية. كعنصر تحكم سلبي ، اترك DCs دون احتضان مع OVAp.
3. عدوى DCs
   1. يصيب DCs بتعدد العدوى (MOI) من 10 بكتيريا (10 بكتيريا لكل تيار مستمر) لمدة ساعة واحدة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).
   2. اغسل خلايا التيار المستمر 3x في PBS و 1x في RMPI 10٪ FBS وأجهزة الطرد المركزي عند 450 × جم من أجل غسل معظم البكتيريا خارج الخلية. أخيرا ، أعد تعليق الخلايا في وسط RMPI 10٪ FBS (بدون مضادات حيوية) عند 20 × 10⁶ خلايا / مل.

2. عزل الخلايا الليمفاوية CD4 ⁺ T من الفئران المعدلة وراثيا OTIIملاحظة: يلخص الشكل 1 هذه الخطوة الثانية. يجب استخدام الغدد الليمفاوية بدلا من الطحال لعزل الخلايا التائية CD4 ⁺ ، لأن نسبة الخلايا الليمفاوية CD4 ⁺ في الغدد الليمفاوية (~ 50٪) أكبر من نسبة الطحال (~ 25٪) وبالتالي فإن التنقية ستكون أكثر فعالية.

1. اصنع معلقا أحادي الخلية للغدد الليمفاوية
   1. قم بإزالة الغدد الليمفاوية الإربية والإبطية والعضدية وعنقية عنق الرحم والمساريق من الفئران المعدلة وراثيا من OTII وانقلها إلى طبق بلاستيكي مع 10 مل من وسط RPMI 10٪ FBS.
   2. طحن الغدد الليمفاوية تحت غطاء معقم باستخدام شريحتين مجهريتين بلوريتين. ضع الغدد الليمفاوية على جانب متجمد من شريحة مجهرية واحدة ، وافركها بالجانب المتجمد من الشريحة الثانية حتى يتم طحن الأعضاء.
   3. اغسل معلق الخلية الواحدة في المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA.
   4. قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلوية (70 ميكرومتر) لإزالة النسيج الضام وغسلها باستخدام المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA.
   5. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من مخزن تحلل ACK واحتضان لمدة 1 دقيقة في RT من أجل القضاء على خلايا الدم الحمراء.
2. عزل الخلايا التائية CD4 ⁺
   1. اغسل مرة أخرى كما في الخطوة 2.1.3 وعد الخلايا لإعادة تعليقها عند 100 × 10⁶ خلايا / مل في المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA. أضف الأجسام المضادة البيوتينيل ضد CD8 و IgM و B220 و CD19 و MHC من الفئة الثانية (I-Ab) و CD11b و CD11c و DX5 عند 1: 250 دقيقة لمدة 30 دقيقة على الجليد للاختيار السلبي لاحقا للخلايا التائية CD4 ⁺ .
   2. اغسل الخلايا في المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA واحتضن الخلايا (100 × 10⁶ خلايا / مل) بميكروبيدات الستربتافيدين بالتركيز الموصى به في بروتوكول الشركة المصنعة لمدة 15 دقيقة على الثلج.
   3. اغسل الخلايا في المخزن المؤقت PBS / BSA / EDTA وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية (30 ميكرومتر) قبل عزل الخلايا التائية CD4 ⁺ .
   4. عزل خلايا CD4 ⁺ T عن طريق الاختيار السلبي باستخدام آلة فصل الخلايا المغناطيسية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   5. عد الخلايا واضبط إلى 4 × 10⁶ خلايا / مل باستخدام وسط RPMI 10٪ FBS (بدون مضادات حيوية).
   6. قم بتثبيت خلايا CD4 ⁺ T المعزولة بالجليد والاحتفاظ بها (3 × 10⁵ خلايا) للتحقق من النقاء عن طريق مقياس التدفق الخلوي. يظهر مثال على تنقية الخلايا التائية CD4 ⁺ في الشكل 3C.

3. قياس انتقال العدوى بالخلايا التائية عن طريق فحص حماية الجنتاميسينملاحظة: يلخص الشكل 2 هذه الخطوة الثالثة من البروتوكول.

1. انتقال الخلايا التائية

1. احتضان خلايا CD4 ⁺ T المعزولة بخلايا DC المصابة (1: 1) (أصيبت DCs لمدة ساعة واحدة وغسلها للقضاء على البكتيريا الحرة) لمدة 30 دقيقة للسماح بتكوين المشبك المناعي في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).

2. أضف 0.5 مل من خلايا CD4 ⁺ T المعزولة (2 × 10⁶ خلايا) و 0.1 مل من الخلايا التائية المصابة (2 × 10⁶ خلايا) على لوحة زراعة 24 بئرا. كعنصر تحكم سلبي ، قم بإصابة 0.5 مل من خلايا CD4 ⁺ T مباشرة في وزارة الداخلية من 10 بكتيريا لمدة 30 دقيقة.

3. قم بتضمين ضوابط إضافية تفصل DCs المصابة عن الخلايا التائية باستخدام حاجز ترانسفور من البولي كربونات (مع 3 ميكرومتر من حجم المسام) ، مما يعيق الاتصال الجسدي DC-T. أضف 0.1 مل من DCs داخل البئر و 0.5 مل من خلايا CD4 ⁺ T إلى الحجرة السفلية من البئر (لوحة 24 بئرا).

4. أخيرا ، استكمل بوسيط RMPI حتى يكون هناك 0.6 مل في كل بئر لعمل أحجام متساوية في جميع العينات.

5. بعد 30 دقيقة من تكوين المشبك المناعي ، أضف 100 ميكروغرام / مل من الجنتاميسين واحتضن لمدة ساعة واحدة قبل جمع الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂).

النتائج

الشكل 1. مخطط انسيابي لتوليد التيار المستمر وعزل الخلايا التائية CD4 ⁺ . على الجانب الأيسر من الشكل ، تم تفصيل عملية التفريق بين الخلايا المتغصنة (DCs) وخلايا نخاع العظم. بعد تشريح عظم الفخذ والظنبوب ، يتم استخراج خلايا نخاع العظم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
RPMI	فيشر العلمية	SH3025501
ص-جي إم سي إس إف	بيبروتك	315-03
لبس	سيغما	L2630-10 ملغ
نا بيروفات	ثيرمو ساينتفيك	SH3023901
2-مي	جيبكو	31350-010
OVAp OTII (323–339)	برنامج GenScript	---
مصفاة خلية 70 ميكرومتر	دينار بحريني	352350
30uM حقنة Filcons معقمة	دينار بحريني	340598
أوتوماكس كلاسيك	ميلتيني بيوتيك	130-088-887
الجنتاميسين	نورمون	624601.6
ترانسويل	كوستار	3415
رطل	برونادىسا	1231
اجار	برونادىسا	1800
بارافورمالديهايد 16٪	علوم المجهر الإلكتروني	15710
تريتون X-100
أحجار CD8	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	استنساخ RMM-1
B220 بيوت	BD Biosciences	553086
أحياء CD19	BD Biosciences	553784
معقد التوافق النسيجي الكبير - II Biot (I-A / I-E)	BD Biosciences	553622
أحياء CD11b	Immunostep	11BB-01 ملغ
أحيائي CD11c	Immunostep	11CB3-01 ملغ
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
القرص المضغوط 16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
مضاد للسالمونيلا	عبد العزيز سيروتيك	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	تونبو للعلوم البيولوجية	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 جسم مضاد للماعز مضاد للأرانب IgG (H + L) ، شديد الامتصاص	إنفيتروجين	أ - 21245
CMAC (7-أمينو-4-كلوروميثيل كومارين)	تقنيات الحياة	طراز C2110
جيش صرب البوسنه	سيغما	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	ميلتيني بيوتيك	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences	---