تقييم ارتباط المكورات الرئوية بالخلايا البطانية البشرية الأولية تحت تدفق الوسائط المستمر

الملخص

المصدر: Jagau, H. et al. عدوى المكورات الرئوية للخلايا البطانية البشرية الأولية في تدفق مستمر. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو التصور في الوقت الفعلي لارتباط المكورات الرئوية بسلاسل عامل فون ويلبراند (VWF) على الخلايا البطانية في ظل ظروف تدفق الوسائط الثابتة. يحدد خطوات تحفيز إطلاق VWF ، وتسمية السلاسل ، وتحديد الارتباط البكتيري.

البروتوكول

1. تحريض عامل فون ويلبراند (VWF) - إطلاق وتصور سلاسل VWF متعددة الدمج

1. حافظ على إعداد التدفق لأن إجهاد القص 10 dyn/cm² مطلوب لتشغيل تعدد VWF إلى سلاسل طويلة تصل إلى 200 MDa. تحفيز إطلاق VWF من WPB البطاني عن طريق حقن 136 ميكرولتر من محلول مخزون الهيستامين 100 ملي مولار في وسط نمو الخلايا البطانية مع مزيج المكملات (ECGMS) - وسط متداول في أنبوب التروية باستخدام منفذ الحقن. سيكون التركيز النهائي للهيستامين في وسط التدفق 1 ملي مولار. في حالة عدم توفر منفذ حقن، يمكن إضافة الهيستامين بدلا من ذلك عن طريق سحب العينات في وسط خزانات المضخة.
2. للكشف عن التألق المناعي لسلاسل VWF متعددة الدمج ، أوقف التدفق عند الوصول إلى مستوى متوسط متوازن في الخزانات وحقن 20 ميكروغرام من الأجسام المضادة المقترنة بالفلوريسين (FITC) الخاصة ب VWF في حجم 200 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (درجة الحموضة 7.4) في 13.6 مل من وسط ECGMS المتداول باستخدام منفذ حقن. في حالة عدم توفر منفذ حقن، يمكن إضافة الجسم المضاد بدلا من ذلك عن طريق سحب العينة في وسط خزانات المضخة. ينتج عن هذا تركيز نهائي للأجسام المضادة يبلغ 1.3 ميكروغرام / مل.
3. للمسح المجهري للعديد من مجالات الرؤية في وقت قصير ، استخدم وحدة التألق في المجهر مع جهاز مضان زينون بقوة 30٪ وكاميرا مضانة. راقب شكل ومورفولوجيا طبقة الخلية البطانية للوريد السري البشري (HUVEC) باستخدام وضع المجال الساطع لاختيار الخلايا التمثيلية المناسبة لتصور سلاسل VWF.
4. لتصور سلاسل VWF الفلورية الخضراء ، حدد هدفا زيتيا 63x / 1.40 ومرشح كشف 470 نانومتر في قائمة وحدة التألق لبرنامج المجهر (LasX). قم بإنشاء لقطات من مكدسات Z لما لا يقل عن 50 عرضا ميدانيا تمثيليا، يحتوي كل منها على ما يقرب من 10 HUVEC سليمة شكليا. لقياس سلاسل VWF الفلورية الخضراء في نقاط زمنية مختلفة ، امسح عدة مجالات رؤية.

2. التقييم المجهري للارتباط البكتيري بسلاسل VWF في التدفق في الوقت الفعلي

1. تحديد ارتباط المكورات الرئوية بسلاسل VWF المتولدة على أسطح خلايا HUVEC عن طريق الكشف عن التألق المناعي.
   1. امسك التدفق وحقن 1.35 × 10⁸ CFU / مل من المكورات الرئوية المعبرة عن بروتين مضان أحمر (RFP) بحجم أقصى 1 مل في وسط ECGMS باستخدام منفذ الحقن. بدلا من ذلك ، قم بسحب البكتيريا في الوسط الموجود في خزان المضخة. أعد تشغيل إجهاد القص عند 10 دين / سم² للسماح للبكتيريا بالدوران داخل نظام المضخة.
   2. حدد هدف غمر الزيت 63x لتكبير المجهر واضبط إعدادات مرشح التألق في برنامج المجهر على قناة RFP (مرشح الكشف 540 نانومتر) للكشف عن المكورات الرئوية المعبرة عن RFP.
   3. لتقدير الارتباط البكتيري بسلاسل VWF ، أوقف التدفق وأنشئ لقطات من مكدسات Z لما لا يقل عن 30 عرضا ميدانيا تمثيليا ، يحتوي كل منها على ما يقرب من 10 HUVEC سليمة شكليا ، واحسب عدد المكورات الرئوية.
   4. استخدم خوارزمية الإحصاء أحادية العامل ANOVA لتقييم البيانات ، متبوعا باختبار عينة غير متزاوج ثنائي الذيل لمقارنة إحصائية مفصلة. اعتبرت قيم P البالغة <0.05 ذات دلالة إحصائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المشبك لأنابيب التروية	المرجع نفسه	10821	لعقد السائل في أنبوب بيفور توصيل الشريحة بنظام المضخة
حاسوب	ديل	الطراز Latitude 3440	Comuter مع برنامج مضخة الضغط
مجهر المسح بالليزر متحد البؤر (CLSM)	لايكا	دي إم آي 8	مجهر عكسي مع مرحلة مغطاة بغرفة قابلة للتسخين ووحدة مضان مزودة بمرشح مضان ومصدر ضوء زينون (SP8 ، DMi8) و DFC 365 FX Kamera (1392 × 1040 ، 1.4 ميجابكسل)
فوسفات هيدروجين البوتاسيوم (KH₂PO₄)	Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه	3904.1	تستخدم لمخزن PBS المؤقت
مواد التجفيف	ميرك	101969	حبات السيليكا البرتقالية للتجفيف تستخدم في زجاجة زجاجية مع محول أنابيب
مزيج مكمل ECGM	بروموسيل	سي -39215	مزيج مكمل لمخطط كهربية القلب والإنارة - متوسط ، مطلوب للزراعة المسبقة للخلايا البطانية: 0.02 مل / مل مصل العجل الجنيني ، 0.004 مل / مل مكمل نمو الخلايا البطانية ، 0.1 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة ، 1 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية ، 90 ميكروغرام / مل الهيبارين ، 1 ميكروغرام / مل هيدروكورتيزون
مخطط كهربية القلب	بروموسيل	سي 22010	مخطط كهربية الصدمة مكمل ب 5٪ [وزن / وزن] FCS و 1 ملي مولار كبريتات المغنيسيوم لزيادة التصاق الخلايا
وسط نمو الخلايا البطانية (ECGM ، جاهز للاستخدام)	بروموسيل	سي 22010	وسط ثقافة HUVECs ، مكمل بالفعل بجميع مكونات مزيج المكملات الغذائية
مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)	بيوكروم الآن ميرك	ق 0415	مكمل غذائي لزراعة الخلايا يستخدم لتحليلات العدوى
الأجسام المضادة للماعز المقترن ب FITC المضادة للإنسان VWF	أبكام	أب8822	تركيز المخزون: 10 مجم / مل ، للكشف المناعي عن التدفق الكروي والمتعدد التدفق
وحدة الموائع	المرجع نفسه	10903	وحدة سوائل لزراعة التدفق
الجيلاتين (الخنازير)	سيجما ألدريتش	جي -1890-100 جرام	للطلاء المسبق لسطح قناة الشريحة الصغيرة
ثنائي هيدروكلوريد الهيستامين	سيجما ألدريتش	إتش -7250-10 مجم	لتحريض إفراز VWF من أجسام Weibel Palade البطانية
الخلية البطانية للوريد السري البشري (HUVEC)	بروموسيل	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	الخلايا البطانية الأولية من متبرع مجمع, مخزنة crypcoserved في النيتروجين السائل
الأجسام المضادة الخاصة ب VWF البشري المشتق من الفأر (أحادي النسيلة)	سانتا كروز	ال 73268	تركيز المخزون: 200 ميكروغرام / مل للتلوين المناعي ل VWF في شريحة الموائع الدقيقة بعد تثبيت PFA
منفذ الحقن	المرجع نفسه	10820	لحقن الهيستامين أو البكتيريا في أنابيب الخزان أثناء دوران التدفق
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	المرجع نفسه	80176	شرائح معدلة فعليا للزراعة المدخنة (μ - الشريحة I0.4Luer بارتفاع قناة 0.4 مم ، وحجم قناة 100 ميكرولتر ، ومساحة نمو 2.5 سم ومساحة طلاء 25.4 سم مربع) مناسبة لجميع أنواع مقايسة التدفق ، تولد المعالجة الفيزيائية سطحا محبا للماء ولاصقا.
كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄ ، غير رطب)	سيجما ألدريتش	M7506-500G	لتحضير وسط مخطط كهربية الرسومات
مضخة الموائع الدقيقة	المرجع نفسه	10905	مضخة ضغط الهواء
مجموعة التروية	المرجع نفسه	10964	يبلغ قطر الأنبوب 1.6 مم ، وطول الأنبوب 50 سم ، وحجم العمل الإجمالي 13.6 مل ، وحجم الأنبوب الميت 2.8 مل وحجم الخزان 10 مل. جنبا إلى جنب مع μ شريحة L0.4Luer ، عند 37 درجة مئوية ولزوجة 0.0072 dyn x s / cm2 ، يمكن الوصول إلى نطاق معدل تدفق 3.8 مل / دقيقة حتى 33.9 مل / دقيقة وإجهاد القص بين 3.5 دين / سم² و 31.2 دين / سم². بطول 50 سم للموائع الدقيقة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)			تم تحضير المحلول باستخدام المواد الكيميائية التالية: 0.2 جم / لتر KCl ، 1.44 جم / لتر Na₂HPO₄ ، 0.24 جم / لتر KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.4
كلوريد البوتاسيوم (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG ، كارلسروه	6781.1	تستخدم لمخزن PBS المؤقت
برنامج التحكم في المضخة (PumpControl v1.5.4)	المرجع نفسه	الإصدار 1.5.4	برنامج كمبيوتر للتحكم في مضخة الضغط وضبط ظروف التدفق وبدء / إنهاء التدفق
المكورات الرئوية المعبرة عن RFP	المجموعة الوطنية لثقافات النوع ، الصحة العامة في إنجلترا	10,319	النمط المصلي العقدية الرئوية 47 الذي يعبر عن RFP المنصهر في بروتين يشبه الهيستون مدمج في الجينوم