التصوير الفلوري للعدوى البكتيرية المرتبطة بالمواد الحيوية في أجنة أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Zhang, X., et al. نموذج جنين سمك الزرد للتصور في الجسم الحي والتحليل داخل الحيوية لعدوى المكورات العنقودية الذهبية المرتبطة بالمواد الحيوية. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو التصوير الفلوري لأجنة أسماك الزرد المحقونة بالمكورات العنقودية الذهبية ، مما يتيح التقدير الكمي لتطور العدوى وتوزيع البكتيريا لتقييم تأثير الكريات المجهرية للمواد الحيوية على تفاعلات المضيف والعامل الممرض في الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. الفحص المجهري الفلوري لتطور العدوى وتسلل الخلايا المستفز في أجنة الزرد

1. قم بتخدير الأجنة عن طريق وضعها في طبق بتري 100 مم يحتوي على 0.02٪ (وزن / حجم) 3-حمض أمينوبنزويك (تريكائين) لتخديرها. بعد 5 دقائق ، يتم نقل الأجنة إلى صفيحة الاغاروز المغطاة بوسط E3 يحتوي على 0.02٪ (وزن / حجم) من التريكائين ومحاذاة في اتجاه واحد للحقن. ماصة 500 ميكرولتر من محلول PBS (محلول ملحي مخزن فوسفات) -2٪ (بالوزن) في طبق بتري يحتوي على وسط E3 مع 0.02٪ (وزن / حجم) تريكاين. ضع الأجنة في محلول ميثيل السليلوز واحتفظ بها مستقيمة وأفقية.
   ملاحظه: يستخدم محلول ميثيل السليلوز ك "غراء" ، والذي بسبب لزوجته ، يمكنه شل حركة الأجنة مؤقتا في أفضل اتجاه للتصوير.
2. استخدم مجهره مضان استريو مزود بمرشحات المجال الساطع ، mCherry ، البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، والأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) لتصوير الأجنة الفردية في ظل إعدادات محسنة متطابقة (على سبيل المثال ، الكثافة والكسب ووقت التعرض) بتكبير 160x. اضبط المستوى البؤري بحيث يكون تلف الأنسجة الناجم عن الحقن في بؤرة التركيز ، باستخدام مرشح المجال الساطع. اضبط عمق المكدس Z على 10 ميكرومتر وحجم الخطوة على 5 ميكرومتر ، مما يسمح بتسجيل 3 صور متتالية.
3. صورة الأجنة الفردية مرة واحدة يوميا من 5 ساعات بعد الحقن حتى يومين بعد الحقن. استبعاد الأجنة الميتة (عدم وجود ضربات قلب أو جنين متدهور جزئيا) لمزيد من التصوير والتحليل. الحفاظ على الأجنة بشكل فردي في وسط E3 في أطباق 48 بئر. قم بتحديث الوسط يوميا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كريات بوليسترين مجهرية قطرها 10 ميكرومتر (فلورسنت أزرق)	تكنولوجيا الحياة / ثيمو فيشر	إف 8829
3-حمض أمينوبنزويك (تريكائين)	سيجما ألدريتش	E10521-50G
مجهر الفلورسنت ستيريو LM80	لايكا	MDG3610450126
ميثيل السليلوز 4000cp	سيجما ألدريتش	MO512-250G
طبق بتري	صقر	353003
طبق بتري	بيوميريو	إن إل -132
إيمج جي	لا ينطبق	لا ينطبق	الرابط: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
لوحة الرسومات 7.0	موشور	لا ينطبق