تحليل في الجسم الحي للالتهابات البكتيرية المرتبطة بالزرع باستخدام أجنة الزرد

الملخص

المصدر: Zhang، X. et al. ، نموذج جنين الزرد للتصور في الجسم الحي والتحليل الحيوي لعدوى المكورات العنقودية الذهبية المرتبطة بالمواد الحيوية. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو نموذج جنين الزرد لدراسة الالتهابات المرتبطة بالمواد الحيوية المزروعة. يعزز حقن المكورات العنقودية الذهبية بالكريات المجهرية من البوليسترين بقاء البكتيريا ، مما يؤكد دور المواد المزروعة في تعزيز العدوى.

البروتوكول

1. تحضير معلقات البكتيريا فقط والبكتيريا المجهرية

ملاحظه: يتم استخدام سلالة المكورات العنقودية الذهبية RN4220 التي تعبر عن بروتين الفلورسنت mCherry (S. aureus-mCherry). ال S. aureus RN4220 سلالة تتحور في الجين منظم الضراوة agrA (منظم الجين الإضافي A) ، وبالتالي ، قد يكون لها ضراوة منخفضة نسبيا في نموذج جنين الزرد. يمكن استخدام سلالات المكورات العنقودية الذهبية الأخرى أو الأنواع البكتيرية الأخرى للعدوى المرتبطة بالمواد الحيوية (BAI).

1. خذ 4 إلى 5 مستعمرات من بكتيريا S. aureus RN4220 من ألواح زراعة أجار الصويا التربتيكية المكملة ب 10 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول وقم بزراعة البكتيريا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة في 10 مل من مرق الصويا التربتيكي المكمل ب 10 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول عند 37 درجة مئوية تحت الرج.
   1. أثناء الاستزراع ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من المعلق البكتيري في 900 ميكرولتر من المحلول الملحي المعقم بالفوسفات (PBS) في كوفيت (عرض 1 سم) لقياس الكثافة الضوئية (OD) عند 620 نانومتر (OD₆₂₀). قم بزراعة البكتيريا حتى يصل OD₆₂₀ إلى 0.4-0.8.
      ملاحظه: يتوافق OD₆₂₀ من 0.1 بشكل عام مع 3.0 × 10⁷ وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) / مل S. aureus. يتراوح OD₆₂₀ لقاح البكتيريا في مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة بين 0.4-0.8. قد تكون هناك حاجة إلى فترات زمنية مختلفة للزراعة للأنواع الأخرى وسلالات البكتيريا.
2. بكتيريا أجهزة الطرد المركزي عند 3,500 × جم لمدة 10 دقائق وإعادة تعليق البكتيريا المحببة في 1 مل من PBS المعقم. بعد ذلك ، اغسل البكتيريا باستخدام PBS المعقم مرتين ، وأخيرا أعد تعليق البكتيريا في 1.1 مل من محلول 4٪ (وزن / حجم) بولي فينيل بيروليدون 40 (PVP40) في PBS.
3. دوامة هذا المعلق البكتيري وتخفيف 100 ميكرولتر من التعليق في 900 ميكرولتر من PBS المعقم في كوفيت لقياس OD₆₂₀ . اضبط تركيز المعلق البكتيري بمحلول PVP40. هذا هو تعليق "البكتيريا فقط".
4. يمكن اختيار المواد الحيوية بحرية لتختلط مع التعليق البكتيري. في هذه الدراسة ، يتم استخدام كريات البوليسترين التجارية (PS) المجهرية (الفلورسنت الأزرق ، 10 ميكرومتر). لتوليد تعليق بكتيريا مجهرية ، قم بالطرد المركزي للكريات المجهرية لمدة دقيقة واحدة عند 1,000 × جم ، ودرجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الكرات المجهرية في التعليق "للبكتيريا فقط" (في محلول PVP40).
5. من أجل حقن جرعات متساوية تقريبا من البكتيريا في وجود الكرات المجهرية وفي غيابها ، يجب أن يكون تركيز تعليق البكتيريا المجهرية ثلثي تركيز معلق "البكتيريا فقط" (بدون كريات مجهرية). يتم تحقيق ذلك عن طريق تخفيف تعليق Bacteria-Microspheres بحجم 0.5 من محلول PVP40. امزج المعلقات عن طريق الدوامة. وتجدر الإشارة إلى أن هذه النسبة (الثلثين) قد تم تقييمها بالنسبة للمكورات العنقودية الذهبية. كما أنه مناسب ل S. epidermidis ، ولكن ينصح بالتحقق مما إذا كانت هذه النسبة تنطبق أيضا على الأنواع البكتيرية الأخرى والأحجام الأخرى (أكثر من 10 ميكرومتر) أو أشكال المواد الحيوية (من الكرات المجهرية) المراد حقنها.
6. تحقق من تركيز تعليق "البكتيريا فقط" و Bacteria-Microspheres عن طريق الزراعة الكمية للتخفيفات التسلسلية بمقدار 10 أضعاف على النحو التالي: نقل 100 ميكرولتر من المعلقات إلى 96 صفيحة بئر وتخفيفها بشكل متسلسل عن طريق نقل 10 ميكرولتر من المعلق إلى 90 ميكرولتر من PBS المعقمة. تكرر اللوحة 10 ميكرولتر من المعلقات غير المخففة والمخففة على ألواح الاغاروز ، وتحتضن الألواح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها ، وعد المستعمرات وحساب عدد البكتيريا (وحدات تشكيل المستعمرة ، CFU).

2. تربية وحصاد وصيانة أجنة الزرد

1. اتبع الإجراءات العامة لتربية وحصاد وصيانة أجنة الزرد ، مع التعديلات الموضحة أدناه. اعبر عائلة من أسماك الزرد ذات الزعانف الطويلة (TL) من النوع البري أو أسماك الزرد من الخط المعدل وراثيا المختار (هنا ، Mpeg1: Kaede) في خزان مع إضافة شبكة لحث الإناث البالغات على إنتاج البيض بعد تشغيل الضوء ، ثم افصل البالغين عن البيض المنتج.
2. في اليوم التالي ، اجمع الأجنة وتخلص من الأجنة غير الشفافة ، والتي لا يمكن حياة. احتفظ بحوالي 60 جنينا لكل طبق بتري (قطره 100 مم) في وسط E3 واحتضنه عند 28 درجة مئوية. قم بإزالة الأجنة الميتة وغير الطبيعية وقم بتحديث الوسط E3 يوميا.

3. تحضير إبر الحقن

1. قم بإعداد الإبر الزجاجية الشعرية الدقيقة للحقن باستخدام أداة سحب الماصة الدقيقة. استخدم الإعدادات التالية: الحرارة: 772 ، السحب: 100 ،: 200 ، الوقت: 40 ، الغاز: 75.
2. اكسر طرف الإبرة بملقط في الموضع الذي يبلغ فيه قطر الإبرة الخارجي حوالي 20 ميكرومتر (للمجهرات 10 ميكرومتر) ، باستخدام مجهر ضوئي مع شريط مقياس في العين. تجنب الإبر ذات حجم الفتحة الكبير جدا ، لأنها ستضر ببقاء الأجنة.
   ملاحظه: يمكن اختيار الفتحة لتكون أصغر أو أكبر ، اعتمادا على حجم وشكل المواد الحيوية المراد حقنها. في الأدبيات ، تم الإبلاغ عن الحقن باستخدام الإبر ذات فتحة حوالي 50 ميكرومتر لتسبب انخفاضا كبيرا في بقاء الجنين.

4. حقن معلق البكتيريا فقط أو بكتيريا الكريات المجهرية في أجنة أسماك الزرد

1. سخني محلول الاغاروز (1-1.5٪ (بالوزن) في نصف ماء) باستخدام فرن الميكروويف واسكبيها في طبق بتري 100 مم. ضع قالب قالب بلاستيكي فوق محلول الاغاروز في طبق بتري لإنشاء فجوات في الاغاروز لوضع الأجنة في المواضع المناسبة وتسهيل الحقن. احتضان في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة القالب عندما يتجمد محلول الاغاروز.
2. بعد 3 أيام من الإخصاب ، ضع الأجنة في طبق بتري 100 مم يحتوي على 0.02٪ (وزن / حجم) 3-حمض أمينوبنزويك (تريكائين) لتخديرها. بعد 5 دقائق ، يتم نقل الأجنة إلى صفيحة الاغاروز المغطاة بوسط E3 يحتوي على 0.02٪ (وزن / حجم) من التريكائين ومحاذاة في اتجاه واحد للحقن. بالنسبة إلى Mpeg1: Kaede الخط المعدل وراثيا ، يقوم أولا بتخدير الأجنة في وسط E3 يحتوي على 0.02٪ (وزن / حجم) تريكين. بعد ذلك ، اختر الأجنة التي تعبر عن بروتينات الفلورسنت الخضراء باستخدام مجهر مضان ستيريو.
3. قم بتحميل الإبرة بحوالي 10 ميكرولتر من معلق "البكتيريا فقط" أو معلق البكتيريا المجهرية باستخدام طرف ماصة اللودر الدقيق. قم بتركيب الإبرة على معالج دقيق متصل بالحاقن الدقيق. بالنسبة للحاقن المستخدم هنا (انظر جدول المواد) ، استخدم الإعدادات التالية لحقن 2-3 نانولتر: الضغط: 300-350 ، الضغط الخلفي: 0 ، الوقت: 2 مللي ثانية. ملاحظة: تعتمد إعدادات الحاقن الدقيق على الحاقن المستخدم. قد تحتاج إعدادات الحاقن إلى التعديل لحقن البكتيريا الممزوجة بالمواد الحيوية ذات الأشكال أو الأحجام الأخرى.
   1. استخدم الإبر ذات الفتحة نفسها لحقن معلق "البكتيريا فقط" وتعليق البكتيريا المجهرية. إذا كانت الإبرة مكسورة أو مسدودة ، فقم دائما بالتغيير لإبرة جديدة لمزيد من الحقن.
4. أدخل الإبرة في الأنسجة العضلية للأجنة تحت مجهر ضوئي (الشكل 1) ، بزاوية 45-60 درجة بين الإبرة وجسم الأجنة. اضبط موضع الإبرة في الأنسجة عن طريق تحريكها برفق ذهابا وإيابا. حقن الأجنة باستخدام دواسة قدم متصلة بالحاقن الدقيق.
5. بعد حقن البكتيريا الفلورية ، قم بتسجيل الأجنة للإصابة الناجحة تحت مجهر مضان ستيريو. تجاهل الأجنة التي سجلت سلبا (لا توجد بكتيريا فلورية مرئية أو لا توجد كريات فلورية مرئية). الحفاظ على الأجنة بشكل فردي في وسط E3 في أطباق 48 بئر. قم بتحديث الوسط يوميا.

5. سحق الأجنة ، والتهديف المجهري ، والثقافة الكمية للبكتيريا

1. قم بتسجيل جميع الأجنة مجهريا لوجود بكتيريا الفلورسنت باستخدام مجهر مضان ستيريو ، بدءا من الحقن مباشرة ، وفي كل يوم لاحق حتى يتم اختيار الأجنة عشوائيا للزراعة الكمية.
2. اختر عشوائيا عددا قليلا من الأجنة الحية المصابة (من 5 إلى 6 في الدراسة الحالية) بعد فترة وجيزة من الحقن وانقلها بشكل فردي لفصل الأنابيب الدقيقة سعة 2 مل باستخدام أطراف معقمة. قم بإزالة الوسط ، واغسل الأجنة برفق باستخدام PBS المعقم مرة واحدة وأضف 100 ميكرولتر من PBS المعقم.
3. أضف 2-3 حبات زركونيا معقمة (قطرها 2 مم) إلى كل قارورة وسحق الأجنة باستخدام الخالط (انظر جدول المواد) عند 3,500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. ثقافة المتجانسة كميا كما هو موضح في الخطوة 1.3.
   ملاحظه: قد تتطلب المجانسات الأخرى إعدادات مختلفة.
4. اختيار أجنة متعددة عشوائيا في الأيام اللاحقة بعد الحقن للاستزراع الكمي وفقا للخطوة 5.3.

النتائج

الشكل 1: الإجراء التخطيطي للحقن المشترك لتعليق البكتيريا والكريات المجهرية في عضلة الذيل لأجنة الزرد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أجار الصويا التربتيك	بي دي ديفكو	236950	وحدة إعداد الإعلام في AMC
مرق الصويا التربتيكي	بي دي ديفكو	211825
بولي فينيل بيروليدون40	تطبيق	ج2259.0250
كريات بوليسترين مجهرية قطرها 10 ميكرومتر (فلورسنت أزرق)	تكنولوجيا الحياة / ثيمو فيشر	إف 8829
زجاج دقيق (1 مم OD × 0.78 مم معرف)	جهاز هارفارد	30-0038
أداة مجتذب الماصة الدقيقة	شركة سوتر إنسترومنت	مشتعل P-97
مجهر ضوئي LM 20	لايكا	الهدف 33 10450123
3-حمض أمينوبنزويك (تريكائين)	سيجما ألدريتش	E10521-50G
الأغروز النائب	روش	11388991001
مجهر الفلورسنت ستيريو LM80	لايكا	MDG3610450126
أطراف ماصة اللودر الصغير	إيبندورف	5242956.003
Micromanipulator M3301 مع حامل M10	الأدوات الدقيقة العالمية	00-42-101-0000
حاقن صغير سريع FemtoJet	إيبندورف	هاتف: 5248ZO100329
ميكروتروب 2 مل pp	سارستيدت	72.693.005
حبات الزركونيا	الاتصال الحيوي	هاتف: 11079124ZX
ماغنا ليزر	روش	41416401
الكلورامفينيكول	سيجما ألدريتش	ج0378
شاكر الدوران (لنمو البكتيريا)	نيو برونزويك العلمية	جي 10
حاضنة سمك الزرد	VWR	خط Incu
كوفيت	وسم	759015
الطرد المركزي	هيتيتش - زنتريفوجن	روتانتا 460R
مطياف	فارماسيا للتكنولوجيا الحيوية	Ultrospec®2000
ملقط	سيجما ألدريتش	F6521-1EA
48 لوحة بئر	غرينر بيو ون	677180
96 لوحة بئر	غرينر بيو ون	655161
طبق بتري	صقر	353003
طبق بتري	بيوميريو	إن إل -132