تحضير لقاح بكتيري أحادي الخلية

الملخص

المصدر: Niu، L.، et al.، تصور موت الخلايا المحللة للبلاعم أثناء العدوى بالفطريات في أجنة الزرد عبر الفحص المجهري داخل الحيوية. J. Vis. خبرة. (2019)

يوضح هذا الفيديو تحضير معلق أحادي الخلية المتفطرة من مزرعة المرحلة المتأخرة للاستخدام المتسق في فحوصات العدوى والتطبيقات النهائية.

البروتوكول

1. تحضير اللقاح أحادي الخلية المتفطرة (الشكل 1)

1. قم بإذابة مخزون الجلسرين المتفطرة الفلورية السيرولين من -80 درجة مئوية وتلقيح صفيحة أجار 7H10 ب 10٪ (حجمي / حجم) OADC (حمض الأوليك ، الألبومين ، سكر العنب ، الكاتلاز) ، 0.25٪ جلسرين ، و 50 ميكروغرام / مل هيجروميسين. احتضن الطبق عند 32 درجة مئوية لمدة 10 أيام تقريبا.
2. حدد مستعمرة تعبر عن التألق الإيجابي وقم بتلقيح 3 مل من 7H9 وسط بنسبة 10٪ OADC و 0.5٪ جلسرين و 50 ميكروغرام / مل هيجروميسين.
   1. احتضان التلقيح عند 32 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) لمدة 4-6 أيام حتى تصل المزرعة إلى المرحلة اللوغاريتمية (OD₆₀₀ = 0.6-1.0).
   2. الاستزراع الفرعي (1: 100) في 30 مل من وسط 7H9 الطازج مع 10٪ OADC و 0.5٪ جلسرين و 0.05٪ Tween-80 و 50 ميكروغرام / مل حتى يصل OD₆₀₀ إلى ~ 1.0.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يوصى بخطوة ثقافة فرعية للحصول على أعلى جودة للثقافة. في تجربتنا ، فإن إضافة الاستنساخ مباشرة إلى حجم كبير من الوسط سيؤدي إلى تكوين كتل بكتيرية.
3. اجمع خلايا M. marinum كما هو موضح أدناه.
   1. جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق لجمع M. marinum كحبيبات. تخلص من كل ما عدا 300 ميكرولتر من المادة الطافية واستخدمها لتعليق الحبيبات.
   2. أضف 3 مل من وسط 7H9 مع 10٪ جلسرين لإعادة تعليق الحبيبات بشكل أكبر ، ثم صوتنة المعلق في حمام مائي عند 100 واط عند 15 ثانية ، 15 ثانية لما مجموعه دقيقتين.
      ملاحظه: يتم استخدام الصوتنة لتحقيق تجانس خلية واحدة للتلقيح ، مما يمنع انسداد إبرة الحقن المجهري.
4. انقل المعلق البكتيري إلى حقنة سعة 10 مل وقم بتمريره عبر مرشح 5 ميكرومتر لإزالة الكتل.
5. قم بقياس الكثافة الضوئية (OD) للتعليق باستخدام مقياس الطيف الضوئي وقم بتخفيفه إلى OD₆₀₀ = 1.0 مع وسائط 7H9 تحتوي على 10٪ جلسرين. قسم المعلق إلى 10 ميكرولتر وتخزينه في الفريزر -80 درجة مئوية لاستخدامه في المستقبل.
6. تأكد من التركيز البكتيري للتلقيح (cfu / mL) عن طريق التخفيف التسلسلي وطلاء المخزون البكتيري على صفيحة أجار 7H10 تحتوي على 10٪ (حجم/حجم) من OADC و 0.5٪ من الجلسرين و 50 ميكروغرام / مل من الهيجروميسين.

النتائج

الشكل 1: رسم تخطيطي لتحضير البكتيريا أحادية الخلية. تم إنشاء مخزونات Mecobacterium marinum أحادية الخلية Cerulean - الفلورية بعد العملية الموصوفة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.05٪ توين -80	سيغما	ص 1379
حقنة 10 مل	سولاربيو	يا0552
10٪ OADC	دينار بحريني	211886
مرشح 5 ميكرومتر	ميل إكس	SLSV025LS
50 ميكرولتر / مل هيجروميسين	سانغون للتكنولوجيا الحيوية	A600230
7H10	دينار بحريني	262710
7ح9	دينار بحريني	262310
غرفة البيئة	بيكون	التحكم في درجة الحرارة 37-2 رقمي
محمل صغير Eppendorf	إيبندورف	No.5242956003.
الجلسرين	سانغون للتكنولوجيا الحيوية	A100854
حاضنه	كيلين	PH-140 (أ)
المتفطرة مارينوم			ATCC BAA-535
سونيكاتور	SCICNTZ	JY92-IIDN
مقياس الطيف الضوئي (OD600)	إيبندورف إيه جي	22331 هامبورغ