الحصول على الأميلويدات السامة للخلايا بعد العدوى البكتيرية للخلايا البطانية الرئوية للفئران

الملخص

المصدر: Balczon, R., et al. طرق الكشف عن الأميلويدات السامة للخلايا بعد إصابة الخلايا البطانية الرئوية بالزائفة الزنجارية. J. Vis. إكسب. (2018)

يوضح هذا الفيديو إجراء توليد مادة طافية سامة للخلايا من الخلايا البطانية الرئوية بعد الإصابة بالزائفة الزنجارية. يوضح كيف تعطل البروتينات المستجيبة البكتيرية بنية الخلية المضيفة وتحفز إطلاق قليلة الأميلويد السامة للخلايا في المادة الطافية.

البروتوكول

1. جيل المواد الطافية السامة للخلايا:

تم الحصول على الثقافات الأولية للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الرئوية للفئران (PMVECs) من مرفق زراعة الخلايا الأساسي في مركز بيولوجيا الرئة بجامعة جنوب ألاباما.

1. لتوليد المواد الطافية السامة للخلايا ، قم بوضع 2 × 10⁶ خلايا في أطباق فردية مقاس 150 سم وتنمو لمدة 3-4 أيام حتى يتم تحقيق التقاء. استخدم لوحين لكل تجربة.
2. لإنتاج مادة طافية ، اغسل أحد الطبقين مقاس 150 سم من PMVECs بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، وقم بالتربسين ، ثم عد الخلايا. اغسل الطبق الآخر من PMVECs بمحلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ثم أصيب بأي من السلالتين من Pseudomonas aeruginosa بتعدد العدوى (MOI) بنسبة 20: 1. ويتحقق ذلك على النحو التالي:
   1. بالنسبة للسودمنيوم الزنجاري ، OD₅₄₀ 0.25 = 2 × 10⁸ CFUs / مل. لتحضير هذا التخفيف ، أضف 1 مل HBSS إلى 1 مل من الكوفيت القابل للتصرف. اكشط ما يكفي من البكتيريا من اللوحة حتى يتم تحقيق OD₅₄₀ من 0.25 عند القياس باستخدام مقياس الطيف الضوئي. ستوفر الخطوة التالية حسابا لكمية البكتيريا المطلوبة.
   2. بمجرد تحديد عدد PMVECs في طبق الاستزراع ، حدد العدد المناسب من البكتيريا التي يجب إضافتها إلى طبق الاستزراع الثاني غير التربسيني الذي يحتوي على PMVECs. على سبيل المثال ، إذا تقرر أن طبق مزرعة PMVECs يحتوي على 1.3 × 10⁷ خلايا ، فقم بإعداد 1.3 × 10⁷ خلايا × 20 بكتيريا / خلية × 1 مل / 2 × 10⁸ CFUs = 1.3 مل من البكتيريا.
   3. قم بتخفيف 1.3 مل من البكتيريا إلى HBSS إلى حجم نهائي يبلغ 20 مل ، بحيث يمكن تغطية سطح طبق 150 سم بالكامل بالسوائل ، ثم أضف البكتيريا المخففة إلى لوحة PMVECs.
   4. احتضان PMVECs الملقحة بالبكتيريا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ 2 لمدة 4-5 ساعات ، حتى يمكن رؤية الفجوات تتشكل في الطبقة الأحادية للخلية عندما يتم ملاحظة الصفيحة مجهريا (انظر الشكل 1 للحصول على المستوى المناسب لتكوين الفجوة).
   5. اجمع المادة الطافية ، ثم قم بجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 2,000 × جم في جهاز طرد مركزي على الطاولة لإزالة الحطام الخلوي.
      ملاحظه: يمكن استخدام أي جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة قادر على توليد قوة g كافية لتحبيب الخلايا غير المتحللة وشظايا الخلايا الكبيرة في هذه الخطوة.
   6. صب المادة الطافية في حقنة بها مرشح 0.2 ميكرومتر متصل بنهايتها ، ثم مرر المادة الطافية عبر المرشح لإزالة البكتيريا.
   7. استخدم كمية من المادة الطافية المعقمة لاختبار السمية الخلوية وتجميد باقي المادة الطافية عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

النتائج

الشكل 1. آثار لقاح المتصورة الزنجارية على مورفولوجيا PMVEC. طبقة أحادية متجمعة من PMVECs قبل (A) وأربع ساعات بعد إضافة (B) سلالة PA103 من P. aeruginosa. يمكن رؤية الفجوات بوضوح في الطبقة الأحادية للخلية في الخلايا المصابة. شريط ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
HBSS	جيبكو	14025-092
برنامج تلفزيوني	جيبكو	10010-023
مرشحات حقنة 0.22 ميكرون	ميليبور	SLGP033RS
دي إم إيه إم	جيبكو	11965-092
عداد الخلايا الآلي للكونتيسة	إنفيتروجين	جيم 10277
مكثفات التجويف الدقيق - قطع 10,000 ميجاوات	ميليبور	UFC801008
سلالات PA103 و ΔPcrV			تم الحصول على سلالات من المتصورة الزنجارية من الدكتور دارا فرانك ، كلية الطب بجامعة ويسكونسن ، ميلووكي ، ويسكونسن
اجار	صياد	BP1423-500
مصل أبقار الجنين	هيكلون	SH30898.03 ساعة
PenStrep	جيبكو	15070063