$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
- تطعيم بالسلالات البكتيرية عن طريق الحقن
- في صباح يوم الحقن ، قم بإزالة التبريد من السلالات البكتيرية التي يتم اختبارها وإذابة الجليد عند 4 درجات مئوية لمدة 3-4 ساعات. قم بإذابة 0.5 مل لكل فأر سيتم حقنه. احتفظ بالقوارير على الجليد بعد الذوبان وحقن الفئران في غضون 2 ساعة.
- بعد الذوبان ، انقل كل مبرد إلى أنبوب جديد سعة 2 مل وجهاز طرد مركزي عند 4,500 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من 1x PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
- جهاز طرد مركزي مرة أخرى عند 4,500 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1x PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 2.5 × 109 CFU / مل (CFU: وحدات تشكيل المستعمرة). ستختلف الكمية الدقيقة ل 1x PBS المستخدمة قليلا بين السلالات.
- خذ 3 عينات من التعليق النهائي لكل سلالة للتحقق من صحة CFU / مل والنمط الجيني والنمط الظاهري كما هو موضح أعلاه.
- لكل سلالة ، قم بتخصيص 1.5 مل من PBS / تعليق الخلية في أنبوب واحد سعة 2 مل لكل 5 فئران للحد من عدد مرات إدخال الأنبوب. أيضا ، قم بإعداد أنابيب 1x PBS لحقن التحكم.
- اجمع الفئران (10 ذكور و 10 إناث C57BL / 6 لكل مجموعة لهذه التجربة) والمواد اللازمة للحقن (المحاقن والإبر وحاويات الأدوات الحادة وأقلام التحديد والقلم والورق وما إلى ذلك). انتقل إلى غرفة جراحة المعقمة. امسح جميع الأسطح بمناديل معقمة.
- للقضاء على الضيق وخطر إصابة المجرب ، قم بإحضار جنس واحد فقط ومجموعة تجريبية من الفئران إلى غرفة الجراحة في كل مرة (على سبيل المثال ، مجموعة من 10 فئران ذكور لتصاب بسلالة معينة). ارتد زوجين من قفازات اللاتكس للتخلص من ثقب القفازات في حالة العض. ارتد معطف المختبر ونظارات السلامة وقناع الوجه لتجنب التلوث.
- ابدأ حقن المجموعة الضابطة ب 1x PBS. وهذا سوف يتأكد مما إذا كانت أي آثار سلبية ناتجة عن الحقن وحدها.
- أخرج الماوس من القفص. قم بإزالة ماوس واحد فقط في كل مرة.
- قم بوزن الماوس ووضع علامة على ذيله بعلامة دائمة لتتبع فقدان الوزن بعد الحقن.
- افتح حقنة جديدة سعة 1 مل وإبرة 27 جم (استخدم حقنة وإبرة جديدة لكل فأر للتخلص من التلوث) وحقن 200 ميكرولتر من 1x PBS المعقمة.
- أمسك الماوس خلف أذنيه باستخدام الإبهام والسبابة. قرصة لإنشاء طية الجلد عند مؤخرة الرقبة للتمسك بها - الطية المشدودة تقلل من حركة الرقبة وخطر التعرض للعض أثناء الحقن. قم بتأمين الذيل في راحة اليد باستخدام الخنصر لتثبيت الماوس بشكل مسطح مع القليل من الحركة.
- اقلب الماوس وأدخل الإبرة بزاوية 30 درجة في التجويف البريتوني إلى الجانب الأيسر أو الأيمن من خط الوسط. ارفع الإبرة قليلا بمجرد إدخالها للتأكد من إدخالها في المنطقة داخل الصفاق وليس في الأعضاء. حقن برنامج تلفزيوني ببطء ثم اسحب الإبرة.
- ضع الإبرة المستخدمة في حاوية أدوات شدة بيولوجية مخصصة. لا تعيد استخدام المحقنة أو الإبرة. البلعة في موقع الحقن نموذجية.
- بعد الحقن ، انقل الماوس إلى قفص منفصل.
- كرر الإجراء بالماوس التالي. بعد حقن جميع فئران قفص واحد ، أعدها إلى قفصها الأصلي على الفور.
- بعد حقن المجموعة الضابطة ، ابدأ في حقن معلقات السلالات ليتم اختبارها باتباع نفس الإجراء.
- حقن 200 ميكرولتر من تعليق الخلية. عند البدء بتعليق الخلية 2.5 × 109 CFU / مل ، يتلقى كل فأر 5 × 108 CFU.
ملاحظه: تم تحسين هذه التركيزات مع البحوث الحيوانية الأولية لتحديد الجرعات المميتة من كل سلالة. قد تحتاج الجرعات إلى تعديل السلالات / الأنواع الأخرى.
- بمجرد اكتمال جميع الحقن ، أعد الفئران إلى غرفة السكن لتخفيف الضيق. منطقة عمل نظيفة بمناديل معقمة.
- راقب بحثا عن نفتها بعد الحقن عن طريق فحص الأقفاص بحثا عن الفئران النافقة كل 3 ساعات لمدة 72 ساعة وكل 12 ساعة لمدة 10 أيام. سجل وزن الفئران كل 12 ساعة لتحديد فقدان الوزن بسبب المرض.