توليد مؤتلفات مزدوجة التقاطع من Pseudomonas aeruginosa لحذف الجينات المستهدفة

الملخص

المصدر: Valentine, M. E., et al. توليد طفرات الحذف الجيني داخل الإطار في الزائفة الزنجارية واختبار توهين الفوعة في نموذج فأر بسيط للعدوى. J. Vis. خبرة. (2020).

يوضح هذا الفيديو توليد المؤتلفات المزدوجة المتقاطعة في Pseudomonas aeruginosa باستخدام استراتيجية حذف الجينات القائمة على البلازميد. تتضمن العملية اختيار البكتيريا التي تحتوي على بلازميد غير متكرر مدمج في الجينوم عبر تقاطع واحد ثم إحداث حدث إعادة تركيب ثان تحت اختيار السكروز لاستئصال البلازميد. يتم تأكيد إعادة التركيب المزدوج الناجح من خلال فقدان مقاومة المضادات الحيوية والقدرة على النمو على الوسائط المحتوية على السكروز.

البروتوكول

1. الكشف عن المؤتلفات المتقاطعة المزدوجة ل P. aeruginosa

1. لكل مزرعة مرق ، قم بتلقيح 10 ميكرولتر من المزرعة على طبق دافئ مسبقا من PIA (Pseudomonas Isolation Agar) مكمل بنسبة 10٪ سكروز (بدون جلسرين) وخط للمستعمرات المعزولة. احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
2. في اليوم التالي ، قم بإزالة الألواح من الحاضنة وفحصها للنمو. يجب أن تكون المستعمرات المقاومة للسكروز مؤتلفات مزدوجة التقاطع (أي إزالة البلازميد من الكروموسوم عبر حدث إعادة التركيب بين المنطقة المتجانسة الأخرى من إدراج البلازميد وكروموسوم المتصورة الزنجارية ).
   1. قم بتصحيح ما لا يقل عن 20 مستعمرة بأعواد أسنان معقمة على أطباق مسخنة مسبقا من: 1) PIA ، 2) PIA مكمل بنسبة 10٪ سكروز (بدون جلسرين) ، و 3) PIA مكمل ب 300 ميكروغرام / مل من الكاربينيسيلين.
3. احتضان الأطباق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
4. قم بإزالة الألواح من الحاضنة وفحصها للنمو. المؤتلفات الحقيقية ذات التقاطع المزدوج ستكون حساسة للكاربينيسيلين ومقاومة للسكروز (أي المستعمرات التي نمت على PIA و PIA المكملة بالسكروز ، ولكنها لم تنمو على PIA المكمل بالكاربينيسيلين).

المواد