تحضير وعزل جراثيم Streptomyces venezuelae من مزرعة سائلة

الملخص

المصدر: Schlimpert, S., et al. تصوير الفاصل الزمني الفلوري لدورة حياة S. venezuelae الكاملة باستخدام جهاز موائع دقيقة. J. Vis. خبرة. (2016)

يوضح هذا الفيديو زراعة وعزل الجراثيم من Streptomyces venezuelae. يتم إنتاج الجراثيم ، وهي خلايا نائمة تساعد البكتيريا على البقاء على قيد الحياة من الإجهاد ، أثناء الحد من المغذيات وتجمعها من خلال الطرد المركزي. تضمن الطريقة تعليق بوغ نقي ومخزن على البارد للتطبيقات النهائية.

البروتوكول

1. عزل جراثيم العقديات الطازجة في فنزويلا وتحضير وسط الثقافة المستهلكة

1. تلقيح 30 مل من مستخلص خميرة المالتوز ومستخلص الشعير (MYM) وسط ، مكمل بمحلول العناصر النزرة R2 (TE) 60 ميكرولتر ، مع 10 ميكرولتر من جراثيم السلالة SV60 [attBφBT1: :p SS209 (Pdiva-divIVA-mcherry PftsZ-ftsZ-ypet)]. لنمو الخلايا وتبويغها بشكل مستمر ، استخدم قارورة محيرة أو قارورة تحتوي على زنبرك للسماح بتهوية كافية.
2. خلايا الاستزراع لمدة 35-40 ساعة عند 30 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة.
3. افحص الخلايا عن طريق الفحص المجهري المتباين على الطور المثبت على السائل. في هذه المرحلة ، ستكون شظايا الفطريات والجراثيم مرئية.
4. جهاز طرد مركزي 1 مل من الخلايا في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة عند 400 × جم لمدة دقيقة واحدة لحبيبات الفطريات وشظايا الخلايا الأكبر.
5. انقل ما يقرب من 300 ميكرولتر من المادة الطافية التي تحتوي على معلق من الجراثيم إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل واحتفظ به على الثلج. حافظ على وسط الثقافة المتبقي
6. قم بتخفيف الجراثيم 1:20 في MYM-TE (التركيز النهائي: 0.5-5 × 10⁷ جراثيم / مل) واحتفظ بها على الثلج لحين الحاجة.
   ملاحظة: على الرغم من أن الظروف الدقيقة التي تؤدي إلى الأبواغ في Streptomyces غير مفهومة ، إلا أن استخدام وسيط MYM-TE المستهلك ، بما في ذلك أي إشارات غير معروفة خارج الخلية من مزرعة البوغ ، يحفز الأبواغ.
7. قم بتصفية تعقيم 10 مل من وسط الاستزراع المتبقي للحصول على MYM-TE المستهلك الخالي من الجراثيم وشظايا الفطريات. استخدم مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر وانقل MYM-TE المستهلك إلى أنبوب معقم سعة 15 مل.
8. احتفظ ب MYM-TE المحضر لبضعة أيام عند 4 درجات مئوية إذا كان سيتم إجراء تجارب إضافية باستخدام ظروف نمو مماثلة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مستخلص مالتوز خميرة الشعير (MYM) 4 جم مالتوز 4 جم مستخلص الخميرة 10 جم مستخلص الشعير أضف 1 لتر H2O باستخدام 50٪ ماء الصنبور و 50٪ ماء التناضح العكسي ومكملات مع 200 مل من محلول العناصر النزرة R2 لكل 100 مل بعد التعقيم			وسط الأبواغ المستخدمة لزراعة Streptomyces venezuelae SV60
R2 محلول العناصر النزرة (TE) 8 مجم ZnCl240 مجم FeCl3-6H 2O2 مجم CuCl2-2H 2O2 مجم MnCl2-4H 2O2 مجم Na2B4O7-10H 2O2 مجم (NH4) 6Mo7O24-4H 2Oadd 200 مل H2OAutoclave وتخزينها عند 4 درجات مئوية			إضافة 0.002 وحدة تخزين إلى MYM
PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات)	سيغما	P4417-100 قرص	تستخدم لإعادة ملء الآبار الداخلية للممرات غير المستخدمة في ألواح B04A من أجل إعداد اللوحة للتخزين على المدى القصير.
مرشحات حقنة 0.22 ميكرومتر	ساتوريوس ستيديم	16532-ك	تحضير MYM-TE المستهلك