تصوير الفاصل الزمني الفلوري لدورة حياة Streptomyces venezuelae

الملخص

المصدر: Schlimpert، S. et al. تصوير الفاصل الزمني الفلوري لدورة حياة S. venezuelae الكاملة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة. J. Vis. Exp. (2016)

يوضح هذا الفيديو التصوير بفاصل زمني مضان لدورة الحياة الكاملة لبكتيريا Streptomyces venezuelae باستخدام جهاز موائع دقيقة لتصور الإنبات ونمو الخيط والأبواغ في الوقت الفعلي.

البروتوكول

1. إعداد المجهر وبروتوكول الفاصل الزمني

ملاحظه: تم تنفيذ هذه الطريقة على مجهر واسع المجال مقلوب بمحرك كامل وآلي مزود بكاميرا sCMOS ومصباح هاليد معدني وضبط تلقائي للصورة للأجهزة وحامل مسرح لألواح 96 بئرا وغرفة بيئية.

1. قم بتسخين الغرفة البيئية مسبقا إلى 30 درجة مئوية مسبقا لمنع حدوث مشاكل في التركيز البؤري التلقائي بعد بدء التجربة. يعتمد الوقت المطلوب على الغرفة البيئية المستخدمة والمجهر ونظام التدفئة. ابدأ في تسخين النظام في الليلة السابقة للتجربة.
2. قم بتشغيل المجهر وبرنامج أتمتة الفحص المجهري والتحكم. استخدم هدف غمر الزيت بفتحة عدسة عددية عالية (NA) للحصول على جمع الإشارات الأمثل والدقة المكانية ، مثل هدف 100X و 1.46 NA للزيت DIC. حدد المرشحات المناسبة والمرايا ثنائية اللون للحصول على صور تباين التداخل التفاضلي (DIC) وصور اندماج البروتين الأصفر الفلوري والأحمر الفلوري.
3. ضع قطرة من زيت الغمر على الهدف وأضف سائل الغمر إلى الجزء السفلي من نافذة التصوير على لوحة الموائع الدقيقة لتحسين تركيز الخلية أثناء التقاط الصورة. قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة المختوم بعناية على مرحلة المجهر المقلوب. تأكد من وضع اللوحة بإحكام في حامل المسرح وعدم تحريكها على مدار التجربة.
4. ضع نافذة التصوير لغرفة زراعة الموائع الدقيقة في التركيز البؤري باستخدام علامات الموضع المضمنة للتوجيه. ركز على الجزء الأيسر من غرفة التدفق الأولى (المسماة "A") بحجم المصيدة 5 ، المقابل لارتفاع المصيدة 0.7 ميكرومتر.
5. في برنامج الموائع الدقيقة ، يتم تحميل خلايا من مدخل البئر 8 عند 4 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 ثانية. تحقق من كثافة الخلايا في غرفة الاستزراع عن طريق تحريك المسرح عبر نافذة التصوير. إذا لم يتم احتجاز الجراثيم ، كرر خطوة تحميل الخلية أو بدلا من ذلك قم بزيادة ضغط التحميل و / أو الوقت حتى يتم تحقيق كثافة الخلية المطلوبة (1-10 جراثيم لكل نافذة تصوير بدقة 2,048 × 2,048 بكسل). تجنب التحميل الزائد على غرفة الاستزراع. ملاحظه: عادة ما نستخدم حجم المصيدة 5 لتصوير Streptomyces ، لكننا حصلنا أيضا على نتائج جيدة مع مقاهي المصيدة 4 و 3.
6. ابدأ برنامج التدفق في برنامج التحكم واسمح للوحة الموائع الدقيقة بموازنة الحرارة لمدة ساعة واحدة في مرحلة المجهر قبل البدء في الحصول على الصور.
7. في برنامج التحكم في المجهر ، قم بإعداد اكتساب متعدد الأبعاد لالتقاط صور متعددة في مواضع مراحل متعددة بمرور الوقت:
   1. بالنسبة للحفظ التلقائي: حدد دليلا للحفظ التلقائي لملفات الصور.
   2. بالنسبة لإعدادات الإضاءة، حدد إعدادات الإضاءة المثلى لكل هيكل محدد مسبقا. بالنسبة للتجربة الموضحة ، استخدم أوقات التعريض الضوئي التالية: DIC 150 مللي ثانية ، YFP 250 مللي ثانية ، RFP 100 مللي ثانية.
   3. بالنسبة إلى السلاسل الزمنية: قم بإعداد سلسلة زمنية للحصول على صور في النقاط الزمنية المطلوبة بالتسلسل. لتصوير دورة حياة S. venezuelae، حدد فاصلا زمنيا مدته 40 دقيقة على مدار فترة 24 ساعة.
   4. بالنسبة لمواضع المرحلة والتركيز البؤري التلقائي: امسح غرفة الثقافة عن طريق تحريك المسرح وتخزين مواضع المرحلة لكل موضع تصوير محل اهتمام. تأكد من أن المواضع أحادية المرحلة متباعدة بما يكفي لتقليل التبييض الضوئي والسمية الضوئية. عادة ، استخدم ما يصل إلى 12 وضعا. قم بتشغيل روتين التركيز البؤري التلقائي لكل نقطة زمنية لتصحيح الانجراف البؤري البطيء. إذا كان متاحا في برنامج التحكم في المجهر، فاضبط استراتيجية التركيز البؤري التلقائي على "تحديث السطح المحلي عن طريق التركيز البؤري التلقائي للأجهزة". بمجرد التحقق من إحداثيات Z لمواضع المرحلة المحددة ، قم بتنشيط التركيز البؤري التلقائي للأجهزة.
8. ابدأ تجربة الفاصل الزمني في برنامج التحكم في المجهر.
9. تحقق من أن جميع مواضع المرحلة لا تزال قيد التركيز في النقاط اللاحقة. بالنسبة لتجارب الفاصل الزمني التي تستمر على مدى عدة ساعات ، نلاحظ أحيانا انجرافا مرحليا حتى عند استخدام التركيز البؤري التلقائي. إذا كانت مواضع المرحلة بحاجة إلى إعادة التركيز ، فأوقف التجربة في نقطة زمنية مناسبة ، واضبط التركيز وأعد تشغيل التجربة خلال الفاصل الزمني المحدد للتصوير.
10. أوقف الحصول على الصور بعد 24-30 ساعة أو عندما تتمايز الخيوط في المنطقة المعنية إلى جراثيم. بعد ذلك ، أوقف برنامج التدفق في البرنامج وقم بتفكيك جهاز الموائع الدقيقة.
11. قم بإعداد لوحة الموائع الدقيقة المستخدمة للتخزين على المدى القصير. قم بإزالة الوسائط المتبقية من البئر 1 إلى 6 ، وأفرغ النفايات جيدا 7 وتحميل الخلية جيدا 8. في ظل ظروف معقمة ، يتم إعادة ملء الآبار المستعملة في الممر "A" وآبار الممرات غير المستخدمة ("B" إلى "D") على الصفيحة بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS). أغلق اللوحة بالبارافيلم لمنعه من الجفاف وتخزينه عند 4 درجات مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
B04A CellAsic ONIX لوحة للخلايا البكتيرية	ميرك ميليبور	B04A-03-5PK	ألواح زراعة الموائع الدقيقة
نظام نضح الموائع الدقيقة CellAsic ONIX و ONIX FG (الإصدار 5.0.2)	ميرك ميليبور	مدخل -262	يمكن العثور على أحدث إصدار من ONIX (يوليو 2015) وتعليمات حول كيفية استخدام البرنامج هنا: http://www.merckmillipore.com
مجهر أكسيو أوبزرفر.Z1	زييس	431007-9902-000	مجهر واسع النطاق مقلوب مؤتمت بالكامل وآليا
حاضنة XL multi S1 مع وحدة درجة الحرارة S1 ووحدة التسخين XL S2	زييس	411857-9061-000	غرفة بيئية تحيط بالمجهر
هدف Plan-Apochromat 100x / 1.46 Oil DIC	زييس	420792-9800-000
أوكرا فلاش 4 V2	هاماماتسو فوتونيكس KK	C11440-22CU
مصباح HXP 120 فولت	زييس	423013-9010-000
مجموعة فلتر FL 46 HE YFP مجانا	زييس	489046-9901-000	مجموعة مرشح الفلورسنت ، الإثارة 500/25 نانومتر ، الانبعاث 535/30 نانومتر
مجموعة مرشحات FL 63 HE RFP shift free	زييس	489063-0000-000	مجموعة مرشحات الفلورسنت ، الإثارة 572/25 نانومتر ، الانبعاث 629/30 نانومتر
إطار التركيب KM لألواح multiwell	زييس	000000-1272-644	حامل المسرح للوحة الموائع الدقيقة
زين برو 2012	زييس	410135-1002-120	برنامج التحكم في المجهر
الفاصل الزمني لوحدة ZEN	زييس	410136-1031-110	وحدة برمجية لإعداد تجارب الفحص المجهري بفاصل زمني
بلاط / مواضع وحدة ZEN	زييس	410136-1025-110	وحدة برمجية لحفظ مواضع مرحلة محددة (xzy)
فيجي	حزمة برامج مفتوحة المصدر	http://fiji.sc/Fiji	إنشاء أفلام اللقطات المتتابعة
PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات)	سيغما	P4417-100 قرص	تستخدم لإعادة ملء الآبار الداخلية للممرات غير المستخدمة في ألواح B04A من أجل إعداد اللوحة للتخزين على المدى القصير.
إس في 60	مجموعة سلالات مركز جون إينيس		سلالة S. venezuelae تعبر عن divIVA-mcherry و ftsZ-ypet