سلوك حشد الزائفة الزنجارية تحت ضغط المضادات الحيوية

الملخص

المصدر: Bru، J.، et al.، تصوير الفاصل الزمني للأسراب البكتيرية والاستجابة الجماعية للإجهاد. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو إجراء تحليل سلوك الاحتشاد ل Pseudomonas aeruginosa من خلال مراقبة نمو البكتيريا من ثقافة مركزية نحو بقع الأقمار الصناعية التي تحتوي على نفس المزرعة الممزوجة بمضاد حيوي ، باستخدام إعداد لوحة أجار وتصوير الفاصل الزمني.

البروتوكول

1. نمو P. aeruginosa وظروف الطلاء

1. قم بإعداد 400 مل من مرق الليسوجيني (LB) عن طريق إضافة 10 جم من مزيج مسحوق LB-Miller إلى 400 مل من ddH₂O. أضف 8 جم إضافية من الأجار للحصول على 2٪ من أطباق LB-agar Petri. الأوتوكلاف للتعقيم.
2. صب 20 مل من وسط LB-agar المنصهر في أطباق بتري قطرها 10 سم واتركها تصلب في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. قم بتخزين الوسائط السائلة في درجة حرارة الغرفة وألواح الأجار عند 4 درجات مئوية.
3. خط P. aeruginosa على طبق بتري LB-agar من مرق مجمد مخزن عند -80 درجة مئوية باستخدام حلقات معقمة أو عصي خشبية. احتضن طبق بتري رأسا على عقب طوال الليل عند 37 درجة مئوية. قم بتخزين طبق LB-agar عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 أسبوع.
4. اختر مستعمرة واحدة من طبق بتري بحلقة معقمة أو عصا خشبية ، وقم بتلقيحها في وسط 2 مل رطل ، واحتضن المزرعة إلى التشبع طوال الليل (16-18 ساعة) عند 37 درجة مئوية في أسطوانة أسطوانية مضبوطة عند 100 دورة في الدقيقة.
5. ماصة 5 ميكرولتر من المزرعة الليلية من الخطوة 1.4 باستخدام ماصة P20 وبقعة في وسط صفيحة أجار السرب عن طريق الاقتراب من طرف الماصة بزاوية (10-45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة الإكتشاف ، وسحب العينة لأسفل حتى المحطة الأولى ، ولمس الأجار بقطرة السائل فقط (الشكل 1 ب).
   1. تجنب لمس الأجار بطرف الماصة ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلاف الأجار. استخدم قالبا لوضع البقعة باستمرار عبر لوحات أجار الاحتشاد المختلفة.
6. بالنسبة للعلاجات بالمضادات الحيوية ، امزج 30 ميكرولتر من المزرعة الليلية المتصورة الزنجارية من الخطوة 1.4 مع 6 ميكرولتر من 3 مجم / مل جنتامايسين ، 10 ميكرولتر من 100 مجم / مل كانامايسين ، أو 7.5 ميكرولتر من 100 مجم / مل فوسفومايسين. انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
   1. ماصة 6 ميكرولتر من المتصورة الزنجارية المعالجة بالمضادات الحيوية باستخدام ماصة P20 وبقعة في 6 مواضع ساتلية متساوية البعد على دائرة متحدة المركز نصف قطرها 2.8 سم حول مركز الطبق عن طريق الاقتراب من طرف الماصة بزاوية (10 إلى 45 درجة) 2.5 سم فوق منطقة الإكتشاف ، وسحب العينة وصولا إلى المحطة الأولى ، ولمس الأجار بقطرة السائل فقط (الشكل 1 د).
   2. تجنب لمس الأجار بطرف الماصة ، لأن ذلك قد يؤدي إلى إتلافه. استخدم قالب طلاء من أجل الاتساق.
7. استبدل أغطية أطباق بتري الشفافة بأغطية سوداء (الشكل 2 أ).
8. ضع ألواح أجار الاحتشاد على ماسح ضوئي في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع حمام مائي سعة 10 لتر للحفاظ على رطوبة 75٪ (الشكل 1 ه ، الشكل 2 ب). أنذر: لا تزعج الخلايا المرقطة على ألواح أجار المحتشدة. حافظ على اللوحات متجهة لأعلى في جميع الأوقات.

النتائج

الشكل 1: تخطيطي ل P. aeruginosa مقايسة الاحتشاد والاستجابة الجماعية للإجهاد. (أ) P. aeruginosa الخلايا تزرع بين عشية وضحاها (16-18 ساعة إلى_{OD 600} من حوالي 1.5) في مر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكواشف
باكتو أجار ، مجفف	بي دي ديفكو	214010	للوحة LB-agar ولوحة أجار الاحتشاد
أحماض الكامينو	بي دي ديفكو	223050	لوسائل الإعلام الجماعية
د الجلوكوز	فيشر للكيماويات	د16500	سكر العنب. لوسائل الإعلام الجماعية
ملح فوسفومايسين ثنائي الصوديوم	طوكيو للصناعات الكيماوية	إف 0889	تركيز المخزون: 200 مجم / مل. مذاب في ddH₂O
كبريتات الجنتاميسين	سيجما ألدريتش	جي 1914	تركيز المخزون: 3 مجم / مل. مذاب في ddH₂O
كبريتات الكاناميسين	سيجما ألدريتش	60615	تركيز المخزون: 100 مجم / مل. مذاب في ddH₂O
إل بي ميلر	بي دي ديفكو	244620	لألواح مرق LB و LB-agar
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات	سيجما ألدريتش	230391	لوسائل الإعلام الجماعية
سلالات
الزائفة الزنجارية	مختبر سيريابورن	رفقة 27E.118	سلالة PA14
مؤن
ورق صنفرة أكسيد الألومنيوم	3 م	150 غرامة	للأغطية السوداء
قماش أسود	جوان	PRD7089	قماش أسود
طلاء بخاخ أسود	كريلون	5592 أسود غير لامع	للأغطية السوداء
قارورة إرلينماير	كيماكس	26500	250 مل
زجاجات تخزين زجاجية	بيركس	13951 لتر	250 مل ، 500 مل ، 1000 مل
8 بوصة ربطات بسحاب	غاردنر بندر	E173770	لربط القماش الأسود غير اللامع
أطباق بتري (100 مم × 15 مم)	صياد	FB0875712	ألواح البوليسترين 100 × 15 مم
عصي خشبية	صياد	23-400-102	لخطوط وتلقيح البكتيريا
معدات
الأوتوكلاف	صناعات السوق	STM-E	لتعقيم الكواشف
ماصة 25 مل	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية، Inc.	1072-5410	لسحب 20 مل لألواح أجار الجماعية
مزيل الرطوبة	فريجيدير	FAD704DWD 70 باينت	للحفاظ على الرطوبة النسبية للغرفة عند حوالي 45٪
حاضنه	VWR	89032-092	لنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية
حمام مائي Isotemp	صياد	15-462-21س	لوسائط التبريد حتى 55 درجة مئوية
غطاء التدفق الصفحي	شركة بيكر	SG603A	لألواح التجفيف
ماصة P-20	جيلسون	F123601	اكتشاف على لوحات أجار السرب
وحدة تحكم الماصة	براند تك	أكيو جيت	لسحب 20 مل لألواح أجار الجماعية