تحريض تمايز ضمة الانحلال الباراهيموليكي إلى خلايا سرب

الملخص

المصدر: Heering, J., et al. تحريض التمايز الخلوي وتصوير الخلية المفردة للضمة paraheemolyticus السباح والخلايا السرية. J. Vis. خبرة. (2017)

يوضح هذا الفيديو تحريض تمايز الخلايا السربية في Vibrio parahaemoemoticus باستخدام وسط أجار معد خصيصا. من خلال التلاعب بالإشارات البيئية مثل استنفاد الحديد ، ومكملات الكالسيوم ، والتلامس السطحي ، يتم تحفيز البكتيريا على الانتقال من شكل السباح إلى خلايا سرب ممدودة مع سوط جانبي. تنتشر هذه الخلايا المتمايزة عبر السطح الصلب ، وتشكل توهجات سرب مميزة تدل على التغيير المورفولوجي الناجح.

البروتوكول

1. تحريض تمايز الخلايا السريب

ملاحظه: توضح الخطوات التالية كيفية إحداث تمايز V. parahaemolyticus في دورة حياة الخلية السريب وكيفية تحفيز التكاثر على الأسطح الصلبة.

1. 4 جم من ضخ القلب (HI) أجار في 100 مل ddH₂O لتحضير ألواح السرب.

2. اغلي محلول HI agar بحذر في الميكروويف ورجي الزجاجة من وقت لآخر حتى يذوب المسحوق. الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.

3. بعد التعقيم ، قم بتبريد أجار HI إلى 60-65 درجة مئوية. أضف 2،2'-Bipyridyl إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ميكرومتر (محلول مخزون 50 ملي مولار في 100٪ إيثانول). أضف CaCl₂ إلى تركيز نهائي قدره 4 ملي مولار (محلول مخزون 4 م في ddH₂O). إذا لزم الأمر ، أضف المضادات الحيوية إلى المحلول للحفاظ على البلازميدات.

ملاحظه: إذا كنت تخطط لاستخدام بلازميد محفز ، أضف عاملا محفزا إلى تركيزه النهائي.

تحذير: 2،2'-بيبيريديل: سمية حادة (عن طريق الفم, الجلد, استنشاق). استخدم القفازات ونظارات السلامة عند التعامل مع هذه المادة الكيميائية.

4. صب 30-35 مل من محلول أجار HI النهائي في طبق بتري دائري 150 مم واترك الأجار يتصلب.

5. قبل اكتشاف مزرعة الخلايا مباشرة ، جفف لوحة الأجار عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل (أو حتى تختفي أي بقايا سائلة ، ولكن ليس بعد الآن) في وضع اليمين بغطاء مفتوح.
ملاحظه: تعتمد أوقات التجفيف بشكل كبير على الحاضنة المستخدمة ولن تسمح الألواح المجففة بشدة باحتشاد V. parahaemolyticus. (هذه الخطوة مهمة جدا!) يجب استخدام اللوحات طازجة ويجب ألا يزيد عمرها عن 2-3 ساعات. ستكون الأطباق القديمة جافة جدا بحيث لا يمكن تحفيز الاحتشاد.

6. تلقيح كمية صغيرة من الخلايا من حافة مستعمرة واحدة في 5 مل من مرق Luria-Bertani (LB). احتضان الثقافة واهتزاز عند 37 درجة مئوية حتى يتم الوصول إلى OD₆₀₀ = 0.8 ، وعادة ما يستغرق الأمر حوالي 2-3 ساعات. بعد ذلك ، تكون الخلايا جاهزة للرصد على ألواح أجار HI الجيد.

7. بقعة 1 ميكرولتر من ثقافة الخلايا في وسط صفيحة حشد أجار HI (الشكل 1 أ).

8. دع البقعة تجف (الشكل 1 ب).

9. أغلق اللوحة بشريط بلاستيكي شفاف وتأكد من تثبيتها بإحكام ، وإلا فقد تنفصل أثناء الحضانة طوال الليل (الشكل 1 ج).

ملاحظه: من المهم جدا أن يكون الختم مثاليا. تجنب تكوين فقاعات الهواء والطيات على الشريط عند تطبيقه.

10. احتضان الطبق عند 24 درجة مئوية طوال الليل. سيؤدي ذلك إلى تكوين V. parahaemolyticus مستعمرة سرب مع مشاعل سرب تمتد من محيط مستعمرة السرب (الشكل 2).

النتائج

الشكل 1: تحريض تمايز السرب وإعداد الخلايا للتصوير المجهري. تصور مبسط لسير العمل لإنتاج خلايا V. parahaemolyticus وإعداد شرائح مجهرية لتحليل المجهري لخلايا السرب المفردة. (أ) بقعة 1 ميكرولتر من OD₆₀₀ = 0.8 ث...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مكونات الوسائط
LB متوسط	روث	عدد X968.3
ديفكو أجار ، حبيبات	دينار بحريني	214510	لتحضير أجار LB مع وسط LB
ديفكو هارت إنفيوجن أجار	دينار بحريني	244400	لتحضير لوحات حشد HI agar
Agarose NEEO ، جودة فائقة	روث	2267.3	لتحضير وسادات الاغاروز المجهرية
المضافات
2،2'-بيبيريديل	سيجما ألدريتش	D216305-25 جرام	لتحضير لوحات حشد HI agar
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات	روث	5239.1	لتحضير لوحات حشد HI agar
الاجهزه
طبق بتري 150 مم × 20 مم مع كاميرات	سارستيدت	82.1184.500	لتحضير لوحات حشد HI agar
كلفيترون تي (ب 6420)	هيريوس	-	تستخدم لتجفيف ألواح احتشاد HI agar