مراقبة العدوى البكتيرية وتوصيل البروتين المستجيب في الخلايا النباتية

الملخص

المصدر: Lee، H. et al. ، نظام البروتين الفلوري الأخضر المنفصل لتصور المؤثرات التي يتم توصيلها من البكتيريا أثناء الإصابة. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة لمراقبة العدوى البكتيرية وتوصيل البروتين المستجيب في الخلايا النباتية باستخدام مكمل البروتين الفلوري الأخضر المنفصل (sfGFP) جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري متحد البؤر. يتيح هذا النهج التصور الدقيق لنقل المستجيب إلى العصارة الخلوية للخلية المضيفة.

البروتوكول

ملاحظه: يتم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. تحضير المواد النباتية (4 أسابيع)

1. التحضير لنباتات Nicotiana benthamiana
   1. زرع 2 بذرة من N. benthamiana على سطح التربة لكل وعاء ، وقم بتغطية الصينية بقبة بلاستيكية واترك البذور تنبت في غرفة نمو 25 درجة مئوية ، 60٪ رطوبة مع دورة ضوئية 16/8 ساعة.
   2. بعد أسبوعين ، اختر أصغر شتلة في كل وعاء وتخلص منها. استمر في زراعة النباتات في ظل نفس ظروف النمو كما هو مطبق للإنبات في الخطوة 1.1.1. أضف 1 لتر من الماء لكل صينية كل يومين.
      ملاحظه: قد تختلف ظروف نمو النباتات باختلاف المختبرات. لذلك ، اتبع بروتوكول الري المنتظم لزراعة النبات في حالة صحية.
   3. في غضون أسبوع ، انقل النباتات إلى صينية جديدة ورتبها بمساحة كافية لمزيد من النمو. استمر في زراعة النباتات في ظل الظروف الموضحة في الخطوة 1.1.1 حتى تصبح جاهزة للتسلل في عمر 4 أسابيع.
      ملاحظه: قد يختلف نمو النبات اعتمادا على ظروف النمو عبر المختبرات. عادة ، نجد أن نباتات N. benthamiana البالغة من العمر 4 أسابيع تحمل حوالي ست أوراق.
2. التحضير لنباتات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا المعدلة وراثيا
   1. ارجع إلى جدول المواد واطلب بذور نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا.
   2. انقع ~ 50 - 100 بذرة نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا في 1 مل من الماء المقطر واحفظها عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام في الظلام لمزامنة بداية الإنبات.
   3. زرع ~ 2-3 بذور على سطح التربة لصينية نبات التوصيل وقم بتغطية الدرج بقبة بلاستيكية. اترك البذور تنبت عند 23 درجة مئوية ، رطوبة 60٪ مع دورة ضوئية فاتحة / داكنة 10/14 ساعة.
      ملاحظه: يجب أن تكون البذور متماثلة اللواقح. ومع ذلك ، نوصي بإعادة تأكيد وجود الجينات المعدلة في الدفعة. في هذه الحالة ، قم بتعقيم البذور عن طريق غسلها بنسبة 70٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، و 50٪ مبيض (حوالي 2٪ هيبوكلوريت) يحتوي على 0.05٪ Triton X-100 لمدة 5 دقائق. يليه الغسيل 5-6 مرات بالماء المعقم المقطر المزدوج (ddH₂O). بعد التعقيم ، قم بتقسيمها إلى طبقات عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام وقم بتغطيتها على وسط إنبات النبات الذي يحتوي على 25 ميكروغرام / لتر من hygromycin B لاختيار النباتات المعدلة وراثيا.
   4. بعد أسبوع ، اترك نبتة واحدة فقط لكل قابس واستمر في زراعة النباتات في نفس ظروف النمو المستخدمة في الخطوة 1.2.3.
      ملاحظه: تم استخدام نباتات عمرها أربعة أسابيع لعدوى Pseudomonas syringae . سقي النباتات كل يومين للحفاظ على صحة النباتات.

2. تحضير ثقافة الزائفة (~ 1 أسبوع)

1. بناء البلازميد لتحويل Pseudomonas
   1. ارجع إلى جدول المواد واطلب المتجه (المتجهات) المطلوبة من متجه نظام توصيل المستجيب القائم على نظام الإفراز من النوع الثالث (T3SS).
   2. أدخل الجين المستجيب ذي الاهتمام في ناقل تسليم المستجيب باستخدام استنساخ إعادة التركيب الخاص بالموقع.
      ملاحظه: عند مراقبة التوطين الخلوي للبروتين المستجيب كامل الطول ، ضع الجين كامل الطول في pBK-GW-1-2 أو pBG-GW-1-2. من الممكن أيضا اختيار pBK-GW-1-4 أو pBG-GW-1-4 يحتوي على 2x sfGFP11 (11th β-strand من sfGFP) لزيادة إشارة التألق. في حالة وجود مستجيب جزئي يفتقر إلى ببتيد إشارة ، استخدم pBK-GW-2-2 أو pBK-GW-2-4.
2. قم بتحويل البلازميد الذي يحمل مستجيبا منصبا في علامة sfGFP11 إلى P. syringae pv. CUCPB5500 الطماطم (Pst) باستخدام التثقيب الكهربائي القياسي.
   ملاحظه: يمكن استخدام سلالات Pseudomonas الأخرى إذا لزم الأمر. تم إنشاء نظام علامة sfGFP11 لمجموعة واسعة من النواقل ، ويتم تنظيم التعبير الجيني للمستجيب بواسطة محفز AvrRpm1 ، والذي يمكن مقارنته ، على سبيل المثال ، Pseudomonas fluorescens (EthAn).
3. انشر الخلايا البكتيرية المحولة برفق على سطح ألواح أجار King's B التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل ريفامبيسين و 25 ميكروغرام / مل كانامايسين أو 25 ميكروغرام / مل جنتامايسين. احتضان عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
4. قم بتلقيح مستعمرة واحدة في الوسائط السائلة King's B بالمضادات الحيوية المناسبة للناقل المستخدم ، وقم بتنمية الخلايا طوال الليل عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
5. اصنع مخزون الجلسرين. أضف الجلسرين المعقم إلى تركيز نهائي بنسبة 50٪ وقم بتخزينه عند -80 درجة مئوية.

3. التعبير العابر ل sfGFP1-10^OPT المستهدف للعضية (1-10 β خيط من sfGFP) في N. benthamiana (4 أيام)

1. تحضير ثقافة البكتيريا الزراعية
   1. اطلب المتجه (المتجهات) المطلوبة من بلازميد (بلازميدات) SFGFP1-10^OPT المستهدفة للعضية (راجع جدول المواد).
   2. تحويل البلازميد (البلازميدات) إلى سلالة Agrobacterium tumefaciens خلايا GV3101. قم بزراعة الخلايا على وسط أجار Luria-Bertani (LB) المكمل ب 50 ميكروغرام / مل كانامايسين و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
   3. من مستعمرة واحدة على وسط أجار LB ، قم بتلقيح الخلايا في 5 مل من وسائط LB السائلة المكملة ب 50 ميكروغرام / مل كانامايسين و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. قم بتنمية الخلايا طوال الليل عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
   4. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق. اسكب الوسائط الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من مخزن التسلل الطازج.
   5. قم بقياس كمية Agrobacterium عن طريق الحصول على قيمة الكثافة الضوئية (OD) عند امتصاص 600 نانومتر (Abs 600 نانومتر). اضبط OD₆₀₀ من البكتيريا على 0.5 باستخدام مخزن مؤقت للتسلل.
      ملاحظة: 1 مل من التعليق يكفي للتسلل إلى نقطتين.
   6. اترك الثقافة في درجة حرارة الغرفة على هزاز لطيف لمدة 1-5 ساعات قبل التسلل.
   7. قم بعمل ثقب في وسط الأوراق ليتم تسللها بطرف 10 ميكرولتر. استخدم حقنة بدون إبر سعة 1 مل للتسرب إلى معلقات Agrobacterium . قم بحقن حوالي 500 ميكرولتر من المعلقات المحضرة من الخطوة 3.1.5 بعناية وببطء في الجانب المحوري للورقة عبر المحقنة. كرر التسلل على ثلاثة نباتات مختلفة على الأقل للتكرارات التجريبية.
      ملاحظه: لأسباب تتعلق بالصحة والسلامة ، يجب ارتداء واقي العين أثناء التسلل.
   8. امسح المعلق البكتيري المتبقي على الأوراق وحدد حدود المنطقة المتسللة.
   9. احتفظ بالنباتات المتسللة تحت نفس ظروف النمو المستخدمة في الخطوة 1.1.1 لمدة يومين.

4. تلقيح الزائفة (4 أيام)

1. خط سلالة Pseudomonas المحولة من مخزون الجلسرين في الخطوة 2.5 على وسائط King's B agar مع المضادات الحيوية المناسبة عند 28 درجة مئوية لمدة يومين.
   ملاحظه: صحة الزائفة أمر بالغ الأهمية. إذا لم تتشكل المستعمرات بشكل جيد ، فقم بربط الخلايا مرة أخرى أو نشر الخلايا في وسائط الملك السائلة قبل المتابعة.
2. قم بتلقيح حلقة من خلايا Pseudomonas في الوسائط السائلة Mannitol-Glutamate (MG) عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة طوال الليل.
3. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3,000 × جم لمدة 10 دقائق. اسكب الوسائط الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 ملي MgCl₂ ، واضبط OD₆₀₀ إلى 0.02 (1 × 10⁷ cfu / مل) لأوراق N. benthamiana وإلى 0.002 (1 × 10⁶ cfu / مل) لأوراق نبات الأرابيدوبسيس.
4. بالنسبة إلى N. benthamiana ، تسلل إلى معلق Pseudomonas إلى منطقة الأوراق حيث تم تسلل البكتيريا الزراعية التي تحمل بنية sfGFP1-10^OPT قبل يومين (كما في الخطوة 3.1.7). بالنسبة إلى نبات الأرابيدوبسيس المعدل وراثيا sfGFP1-10^OPT ، قم بتسلل معلق Pseudomonas إلى ورقتين قصيرتين عمرهما 4 أسابيع.
   ملاحظه: هناك حاجة إلى ثلاثة نباتات على الأقل للتكرارات التجريبية.

5. مراقبة إشارة sfGFP عبر الفحص المجهري متحد البؤر (يوم واحد)

1. اقطع قرص الأوراق من الأوراق الملقحة ب Pseudomonas. في نقاط زمنية محددة بعد تسلل Pseudomonas ، قم بتصوير قرصين^{من 2} ورقة 2 من النبات الفردي باستخدام نظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر مع هدف الغمر في الماء C-Apochromat بفتحة عددية 40X / 1.2 (NA) أو هدف غمر الزيت 63X / 0.8 NA C-Apochromat. لتجنب قتل الخلايا الميتة بسبب الجرح ، راقب الخلايا البعيدة عن فتحة التسلل.
2. ابدأ الملاحظة عند إعداد طاقة منخفضة لليزر الأرجون 488 نانومتر. زيادة قوة الليزر للكشف عن sfGFP.
   ملاحظه: عادة ما نستخدم 2-15٪ من شدة الليزر للكشف عن إشارة التألق. ومع ذلك ، يجب ضبط إعدادات طاقة الليزر والكشف بناء على نظام الفحص المجهري للمستخدم. هنا ، تم ضبط مرشحات الانبعاثات على 520-550 نانومتر. غالبا ما تنبعث الخلايا الميتة من التألق التلقائي تحت إثارة الليزر 488 نانومتر. لذلك ، كعنصر تحكم سلبي ، يجب اختراق نفس المستجيب بدون علامة sfGFP11 ومراقبته في ظل نفس ظروف المراقبة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تؤدي الإثارة العالية بالليزر إلى تألق الكلوروفيل الذاتي. لذلك ، اضبط شدة الليزر باستخدام الخلايا النباتية للتحكم حتى لا تحفز التألق الذاتي للكلوروفيل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خطوط نبات الأرابيدوبسيس المعدلة وراثيا			بارك ، إي ، لي ، إتش واي ، وو ، جيه ، تشوي ، د. ودينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات الحقن الزائفة عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسمة. خلية نباتية. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	ABRC	CS69831
NU-SFGFP1-10	ABRC	CS69832
PT-sfGFP1-10	ABRC	CS69833
MT-sfGFP1-10	ABRC	CS69834
PX-sfGFP1-10	ABRC	CS69835
ER-SFGFP1-10	ABRC	CS69836
GO-SFGFP1-10	ABRC	CS69837
PM-SFGFP1-10	ABRC	CS69838
البلازميد sfGFP1-10OPT المستهدف للعضية			بارك ، إي ، لي ، إتش واي ، وو ، جيه ، تشوي ، د. ودينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات الحقن الزائفة عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسمة. خلية نباتية. 29 (7), 1571-1584 (2017)
CYTO-sfGFP1-10	أدجين	97387
NU-SFGFP1-10	أدجين	97388
PT-sfGFP1-10	أدجين	97389
MT-sfGFP1-10	أدجين	97390
PX-sfGFP1-10	أدجين	97391
ER-SFGFP1-10	أدجين	97392
GO-SFGFP1-10	أدجين	97393
PM-SFGFP1-10	أدجين	97394
ER-sfCherry1-10	أدجين	97403
ER-sfYFP1-10	أدجين	97404
سيتو-SFCFP1-10	أدجين	97405
ناقل متوافق مع بوابة sfGFP11 لنظام تسليم المستجيب المستند إلى T3SS	بارك ، إي ، لي ، إتش واي ، وو ، جيه ، تشوي ، د. ودينيش كومار ، إس بي المراقبة الزمانية المكانية لمؤثرات الحقن الزائفة عبر إفراز النوع الثالث باستخدام شظايا البروتين الفلوري المنقسمة. خلية نباتية. 29 (7), 1571-1584 (2017)
بي بي كيه-جي دبليو-1-2	أدجين	98250	pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي كيه-جي دبليو-1-4	أدجين	98251	pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي كيه-جي دبليو-2-2	أدجين	98252	pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي كيه-جي دبليو-2-4	أدجين	98253	pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاوم للكاناميسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي جي جي جي -1-2	أدجين	98254	pAvrRpm1: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتامايسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي جي جي -1-4	أدجين	98255	pAvrRpm1: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتامايسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي جي-جي دبليو-2-2	أدجين	98256	pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-sfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتامايسين (25 ميكروغرام / مل)
بي بي جي جي -2-4	أدجين	98257	pAvrRpm1: AvrRPM1sp: GW: HA-2xsfGFP11: AvrRpm1t ؛ مقاومة للجنتامايسين (25 ميكروغرام / مل)
سلالات بكتيرية
Agrobacterium tumefaciens GV3101			يتحكم Csaba Koncz و Jeff Schell ، مروج جين TL-DNA 5 في التعبير الخاص بالأنسجة للجينات الخيمرية التي يحملها نوع جديد من ناقل Agrobacterium الثنائي. مول جنرال جينيه. 204,383-396 (1986); مقاومة للجنتامايسين (50 ميكروغرام / مل) وريفامبيسين (50 ميكروغرام / مل)
Pseudomonas syringae الكهروضوئية. CUCPB5500 الطماطم			كفيتكو ، بي إتش وآخرون. عمليات الحذف في ذخيرة Pseudomonas syringae الكهروضوئية. تكشف جينات مستجيب إفراز الطماطم DC3000 من النوع الثالث عن تداخل وظيفي بين المستجيبات. بلوس باثوج. 5 (4) (2009).; مقاومة للريفامبيسين (100 ميكروغرام / مل)
مكونات الوسائط
وسائط إنبات النبات			أضف 2.165 جم / لتر من مسحوق Murashige & Skoog ، 10 جم / لتر من السكروز إلى الماء. اضبط على درجة الحموضة 5.8 وأضف 2.2 جم / لتر من نبات نباتي. أوتوكلف.
وسط Murashige & Skoog بما في ذلك الفيتامينات	دوشيفا بيوكيمي	م 0222	يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
سكروز	دوشيفا بيوكيمي	س 0809
فيتاغيل	سيجما ألدريتش	ص 8169
وسائط LB			أضف 10 جم / لتر من التربتون ، 5 جم / لتر من مستخلص الخميرة ، 10 جم / لتر من كلوريد الصوديوم إلى الماء. بالنسبة للوسائط الصلبة ، أضف 15 جم / لتر أجار صغير. الأوتوكلاف. اترك المحلول ليبرد إلى 55 درجة مئوية ، وأضف مضادا حيويا إذا لزم الأمر.
التربتون	BD Bioscience	211705
مستخلص الخميرة	BD Bioscience	212750
كلوريد الصوديوم	دوشيفا بيوكيمي	ط0520
ميكرو أجار	دوشيفا بيوكيمي	م 1002
كينغز ب ميديا			10 جم / لتر ببتون بروتياز # 2 ، 1.5 جم / لتر لا مائي K2HPO4 ، 15 جم / لتر من أجار إلى الماء. الأوتوكلاف. تبرد إلى 55 درجة مئوية وأضف 15 مل / لتر جلسرين معقم ، 5 مل / لتر MgSO4 إلى الوسط. أضف المضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
بتون بروتيوز	BD Bioscience	212120
اللامائي K2HPO4	سيجما ألدريتش	1551128 USP
الجلسرين	دوشيفا بيوكيمي	طراز G1345
MgSO4	سيجما ألدريتش	م 7506
باكتو أجار	BD Bioscience	214010
الوسائط السائلة مانيتول غلوتامات (MG)			أضف 10 جم / لتر من المانيتول ، و 2 جم / لتر من حمض L-glutamic ، و 0.5 جم / لتر من KH2PO4 ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.2 جم / لتر من MgSO4 إلى الماء. اضبط على الرقم الهيدروجيني 7
مانيتول	دوشيفا بيوكيمي	م 0803
حمض الجلوتاميك	دوشيفا بيوكيمي	جي 0707
KH2PO4	سيجما ألدريتش	NIST200B
عازلة التسلل			10 ملي مولار MES (2- (N-morpholino) -حمض السلفونيك الإيثاني) ، 10 ملي مولار MgCl2 ، 150 ميكرومتر أسيتوسرينجون. درجة الحموضة 5.6 ؛ قم بإعداد مخزن مؤقت جديد قبل الاستخدام.
مس	دوشيفا بيوكيمي	م 1503	تحضير مخزون 100 ملي مولار (درجة الحموضة 5.6) في الماء. تصفية تعقيم.
MgCl2	سيجما ألدريتش	م 8266	تحضير 100 مللي متر في الماء. الأوتوكلاف.
أسيتوسرينجون	سيجما ألدريتش	D134406	تحضير مخزون 150 ملي مولار في DMSO.
معدات / مواد المجهر متحد البؤر
710 نظام متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر	كارل زايس
مجهر Axio observer Z1 المقلوب	كارل زايس