عزل المستعمرة البكتيرية المستهدفة باستخدام تحلل الهيدروجيل المزخرف بالضوء

Abstract

المصدر: فتاحي، ن.، وآخرون. واجهات هيدروجيل قابلة للتحلل ضوئي لفحص البكتيريا واختيارها وعزلها. J. Vis. خبرة. (2021).

يوضح هذا الفيديو استخراج المستعمرات البكتيرية من هيدروجيل قابل للتحلل ضوئي باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يتم اختيار مستعمرة معينة ، وتم تصميم التعرض للضوء المزخرف لبدء تحلل الهيدروجيل الموضعي. بعد ضبط شدة الضوء ومدته ، يتم تطبيق ضوء الأشعة فوق البنفسجية ، وإطلاق المستعمرة. ثم يتم شفط المستعمرة من خلال الأنابيب ونقلها إلى أنبوب لتحليل المصب.

Protocol

1. السلالات البكتيرية وبروتوكولات الاستزراع

1. مستعمرات خطوط من البكتيريا على لوحات أجار تستكمل مع وسائل الإعلام النمو المناسبة. في هذا التقرير ، B. subtilis (سلالة 1A1135 ، مركز المخزون الوراثي للعصيات) يتم استزراعها على ATGN (0.079 M KH₂PO₄ (فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم) ، 0.015 م (NH₄) ₂SO₄ (كبريتات الأمونيوم) ، 0.6 ملي مولار MgSO₄ · 7H₂O (كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات) ، 0.06 ملي مولار CaCl₂ · 2 H₂O (ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم) ، 0.0071 ملي مولار MnSO₄ · H₂O (مونوهيدرات كبريتات المنغنيز (II)) ، 0.125 M FeSO₄ · 7H₂O (سباعي هيدرات كبريتات الحديدوز) ، 28 ملي مولار جلوكوز ، درجة الحموضة: 7 ± 0.2 ، 15 جم / لتر أجار) ألواح أجار مكملة ب 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين والإشريكية القولونية (سلالة 25922 ، ATCC) على ألواح أجار ATGN مكملة ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين.
   ملاحظة: التقارير السابقة عن تغليف الهيدروجيل وإطلاقه بهذه المواد تستخدم خلايا A. tumefaciens C58
2. اختر المستعمرات المرغوبة من ألواح أجار ATGN وابدأ الثقافات بين عشية وضحاها. بالنسبة للإشريكية القولونية و B. subtilis السلالات المستخدمة هنا ، يتم الاستزراع عند 37 درجة مئوية أثناء الاهتزاز عند 215 دورة في الدقيقة في وسط سائل ATGN لمدة 24 ساعة. قم بتخزين مزارع الخلايا في 50٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام في المستقبل.
3. اختر مستعمرات كلتا السلالتين من مخزون الجلسرين باستخدام حلقات تلقيح معقمة واحتضان في وسائط سائلة ATGN لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 215 دورة في الدقيقة.

2. تحضير المواد اللازمة لتشكيل الهيدروجيل

1. تخليق PEG-o-NB-diacrylate القابل للتحلل الضوئي (بولي (إيثيلين جلايكول) - أورثو-نيتروبنزيل - دياكريليت)
   ملاحظة: تم وصف التوليف الداخلي ل PEG-o-NB-diacrylate جيدا والإبلاغ عنه سابقا. بدلا من ذلك ، نظرا لأن التوليف روتيني ، يمكن الاستعانة بمصادر خارجية من منشأة التخليق الكيميائي.
2. المخزن المؤقت للتشابك
   1. خذ وصفة الوسط المختار للسلالة البكتيرية وقم بإعداد الوسائط ب 2x العناصر الغذائية. أضف الفوسفات ، على سبيل المثال ، هيدروكسيد الصوديوم₂PO₄ (فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم) ، إلى الوسط إلى تركيز نهائي يبلغ 100 ملي مولار. ثم اضبط قيمة الأس الهيدروجيني على 8 باستخدام 5 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) (مائي).
   2. قم بتعقيم المحلول العازل وتخزينه في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: اترك أي معادن انتقالية موجودة في الوسائط ، لأن هذه المعادن تحفز أكسدة الثيول إلى ثاني كبريتيدات.
3. حل PEG-o-NB-diacrylate
   1. لكل ملغ من مسحوق aliquot PEG-o-NB-diacrylate (3,400 Da الوزن الجزيئي) ، أضف 3.08 ميكرولتر من الماء عالي النقاء للوصول إلى تركيز 49 ملي مولار من PEG-o-NB-diacrylate (تركيز 98 ملي مولار أكريلات).
   2. دوامة المحلول حتى يمتزج جيدا وقم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
4. محلول PEG-thiol ذو 4 أذرع
   1. لتحضير PEG-thiol رباعي الأذرع (10,000 Da الوزن الجزيئي) ، أضف 4 ميكرولتر من الماء فائق النقاء لكل مجم مسحوق للوصول إلى تركيز 20 ملي مولار (80 ملي مولار من تركيز الثيول).
   2. قم بتدوير هذا المحلول حتى يمتزج جيدا وقم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.

3. تحضير أغطية مشبعة بالفلور (غير متفاعلة)

1. ضع ما يصل إلى 5 شرائح زجاجية (25 مم × 75 مم × 1 مم) داخل بريد منزلق من مادة البولي بروبلين. صوتنة الشرائح باستخدام محلول منظف 2٪ (وزن / حجم) (جدول المواد) لمدة 20 دقيقة.
2. اشطف الشرائح ثلاث مرات بالماء فائق النقاء ، ثم صوتنة الشرائح في الماء لمدة 20 دقيقة. جفف الشرائح باستخدام تيار من N₂ (نيتروجين).
3. تنظيف البلازما (انظر جدول المواد) على جانبي الشرائح الزجاجية وفقا للبروتوكول الوارد في القسم 4.1 لمدة دقيقتين.
4. ضع الشرائح التي تم تنظيفها بالبلازما مرة أخرى في بريد الشريحة واملأ الحاوية بمحلول 0.5٪ (حجمي / حجمي) من ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H ، -perfluorooctyl) سيلان في التولوين. اسمح لهذه الشرائح الزجاجية بالتشغيل لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT).
5. بعد تشغيل الشرائح ، اشطف الشرائح داخل بريد الشريحة ، أولا بالتولوين والإيثانول التالي (ثلاث مرات مع كل مذيب). بعد ذلك ، جفف كل شريحة وظيفية بتيار N₂.

4. تحضير أغطية (قاعدة) وظيفية

1. تنظيف الأغطية الزجاجية باستخدام منظف البلازما
   1. ضع أغطية مقاس 18 مم × 18 مم في طبق بتري. بعد ذلك ، ضع طبق بتري في غرفة تنظيف البلازما وقم بتشغيل منظف البلازما.
   2. قم بتشغيل مضخة التفريغ لتنقية الهواء داخل الغرفة حتى يقرأ مقياس الضغط 400 مللي متر مربع.
   3. افتح صمام القياس للسماح للهواء بالدخول إلى الغرفة حتى يصل مقياس الضغط إلى ضغط ثابت (800-1000 mTorr). بعد ذلك ، حدد RF مع وضع "Hi" وقم بكشف الأغطية لمدة 3 دقائق.
   4. بعد 3 دقائق ، قم بإيقاف تشغيل وضع التردد اللاسلكي ومضخة التفريغ.
   5. أخرج طبق بتري من الغرفة ، واقلب الأغطية ، وضعها مرة أخرى في الغرفة إلى البلازما ، وفضح الجانب الآخر من الغطاء الزجاجي.
   6. كرر الخطوات 4.1.2-4.1.4 لتنظيف الجانب غير المعالج من الغطاء الزجاجي بالبلازما.
   7. بعد الانتهاء من العملية ، قم بإزالة طبق بتري من الغرفة وقم بإيقاف تشغيل منظف البلازما ومضخة التفريغ.
2. تنظيف وهيدروكسيل الأغطية بمحلول أسماك الضاري المفترسة
   ملاحظة: يمكن استخدام بروتوكولات تنظيف أسماك الضاري المفترسة القياسية لتنظيف زلات الزجاج وهيدروكسيلات. محلول سمكة البيرانا عبارة عن خليط 30:70 (حجمي / حجمي) من H₂O₂ (بيروكسيد الهيدروجين) و H₂SO₄ (حمض الكبريتيك). يمكن أيضا استخدام طرق بديلة لتنظيف الأغطية الزجاجية.
   تحذير: محلول سمكة البيرانا شديد التآكل والانفجار مع المذيبات العضوية ويجب التعامل معه بحذر شديد. يجب تنفيذ تدابير السلامة والاحتواء المناسبة ، مثل استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر ، المئزر المقاوم للمواد الكيميائية ، نظارات السلامة ، واقي الوجه ، قفازات البوتيل المقاومة للأحماض). يجب أن تكون جميع الأواني الزجاجية وأسطح العمل الملامسة لمحلول أسماك الضاري المفترسة نظيفة وجافة وخالية من المخلفات العضوية قبل الاستخدام. لا ينبغي أبدا تخزين محلول سمكة البيرانا في حاوية مغلقة جزئيا أو مغلقة.
   1. ضع طبقا زجاجيا نظيفا مقاس 100 مم × 50 مم على محرك مغناطيسي للوحة التسخين مع سرعة تحريك قابلة للتعديل تحت غطاء الدخان وأضف 14 مل من H₂SO₄ إلى الطبق.
   2. ضع برفق قضيب تقليب مغناطيسي صغير مغطى بالتفلون باستخدام ملقط مغطى بالتفلون داخل الطبق. ثم أدر النمام ببطء لتجنب تناثر الحمض.
   3. بعد ذلك ، أضف برفق 6 مل من H₂O₂ إلى الطبق واترك المحلول يمتزج جيدا.
   4. أغلق النمام ، ثم أخرج شريط التقليب من الطبق باستخدام الملقط. بعد ذلك ، ضع الأغطية برفق داخل الطبق باستخدام الملقط واضبط درجة الحرارة على 60-80 درجة مئوية.
   5. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة الأغطية برفق باستخدام الملقط واغمرها في ماء منزوع الأيونات (DI) مرتين لغسل محلول سمكة البيرانا المتبقي.
   6. بعد الشطف بالماء ، قم بتخزين الأغطية في ماء DI في RT حتى الاستخدام مرة أخرى.
   7. أغلق لوح التسخين واترك محلول أسماك الضاري المضمنة يبرد.
   8. للتخلص من محلول سمكة الضاري المفترسة ، ضع الطبق الزجاجي مقاس 100 مم × 50 مم الذي يحتوي على محلول أسماك الضاري المفترسة المبرد برفق في دورق زجاجي أكبر وفارغ لا يقل حجمه عن 1.5 لتر. ثم أضف 1 لتر من الماء لتخفيفه وأضف مسحوق بيكربونات الصوديوم لتحييده. لاحظ أن بيكربونات الصوديوم ستسبب الفقاعات وتوليد الحرارة ويجب إضافتها ببطء شديد ؛ خلاف ذلك ، قد تؤدي الفقاعات إلى تناثر الحمض. عندما لا تتسبب إضافة بيكربونات الصوديوم الإضافية في حدوث فقاعات ، تحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام ورق الأس الهيدروجيني للتحقق من تحييده. بمجرد تحييد المحلول وتبريده ، يمكن سكبه في الحوض.
3. وظيفة الثيول من الأغطية
   1. قم بإعداد محلول 5٪ (حجم/حجمي) من 269 ملي مولار من محلول (3-ميركابتوبروبيل) تريميثوكسيسيلان (MPTS) في التولوين الجاف.
   2. أضف 10 مل من المحلول إلى أنابيب الطرد المركزي المخروطية الفردية سعة 50 مل. ضع غطاء نظيفا واحدا في كل أنبوب واغمره في المحلول.
      ملاحظة: يتم استخدام غطاء واحد لكل أنبوب سعة 50 مل لضمان تجميع جانبي الركيزة دون إزعاجه من الركائز الأخرى.
   3. بعد 4 ساعات ، اغسل كل غطاء (أربع غسلات لكل غطاء) بالتولوين ، والإيثانول 1: 1 (حجمي / حجمي): خليط التولوين ، والإيثانول.
      ملاحظة: يتم ذلك عن طريق غمر كل غطاء بالتتابع في أنابيب الطرد المركزي المخروطية التي تحتوي على المحاليل المذكورة.
   4. بعد شطف الركيزة ، اغمرها في الإيثانول واحفظها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مرة أخرى.
      ملاحظة: اعتمادا على عدد الأغطية ، يمكن أن تصبح هذه الطريقة شاقة بسبب معالجة الأغطية واحدة تلو الأخرى. بالنسبة لأغطية متعددة ، يمكن استخدام برطمانات كولومبيا التي تناسب العديد من الأغطية في نفس الوقت.

5. تصنيع مصفوفات السيليكون microwell

1. طلاء الباريلين: استخدم البروتوكول القياسي الموضح في المقالات البحثية السابقة لطلاء رقائق السيليكون بالباريلين.
2. التصنيع الدقيق: اتبع البروتوكول الموصوف من قبل Barua et al. لتصميم وتصنيع مصفوفة microwell. ​

6. تشكيل هيدروجيل

1. تشكيل هيدروجيل سائب على أغطية زجاجية
   1. محلول سلائف هيدروجيل: أضف 12.5 ميكرولتر من المخزن المؤقت المتشابك إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق 0.5 مل ، متبوعا ب 5.6 ميكرولتر من محلول PEG-o-NB-diacrylate. أخيرا ، أضف 6.9 ميكرولتر من محلول PEG-thiol ذو 4 أذرع إلى الخليط.
      ملاحظة: تؤدي إضافة ثيول PEG ذو 4 أذرع إلى الخليط إلى بدء تفاعل التشابك. وبالتالي ، يجب استخدام محلول السلائف هيدروجيل مباشرة بعد الخلط.
   2. لتغليف الخلايا في محلول سلائف الهيدروجيل ، اتبع الخطوات 6.1.3-6.1.9.
   3. لتغليف الخلية ، قبل الخطوة 6.1.1 ، قم بتلقيح المخزن المؤقت المتشابك بكثافة الخلية المطلوبة. كما ورد سابقا 19 ، لوحظ أن كثافة الخلية 7.26 × 10⁷ CFU / مل في المخزن المؤقت المتشابك ترتبط بكثافة ~ 90 خلية / مم² مغلفة عبر الهيدروجيل.
   4. ضع غطاء القاعدة المثيل على طبق بتري نظيف. ضع فاصلتين (انظر جدول المواد) على الجانبين المتقابلين من الغطاء.
      ملاحظة: يعد تشغيل الثيول للأغطية ضروريا للربط التساهمي للهيدروجيل بسطح الغطاء. يتم ذلك من خلال تفاعل مجموعات الثيول على السطح ومجموعات الأكريليت الموجودة في محلول سلائف الهيدروجيل.
   5. قم بتثبيت الفواصل على غطاء القاعدة عن طريق لصق الفواصل على طبق بتري.
   6. ماصة الحجم المطلوب من محلول السلائف على شريحة زجاجية غير تفاعلية مشبعة بالفلور ألكيل.
   7. ضع الشريحة الزجاجية المشبعة بالفلور على غطاء القاعدة (الشكل 1 ج). انتظر لمدة 25 دقيقة في RT حتى يكتمل تكوين الهيدروجيل.
   8. بعد التبلور ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية المشبعة بالفلور برفق. سيبقى الهيدروجيل متصلا بغطاء القاعدة. ​
      ملاحظة: بالنسبة للأغطية مقاس 18 مم × 8 مم للحصول على غشاء بسمك 12.7 ميكرومتر ، استخدم ~ 7 ميكرولتر من محلول السلائف (الشكل 1 أ ، ب). قد يؤدي استخدام كميات أكبر من محلول السلائف إلى هيدروجيل أسفل غطاء القاعدة. قد يتسبب ذلك في التصاق غطاء القاعدة بطبق بتري وكسره عند محاولة الإزالة. أيضا ، تشكل بقايا الهيدروجيل الموجودة أسفل الغطاء مشكلة في الفحص المجهري. مطلوب إزالة لطيفة للشريحة الزجاجية المشبعة بالفلور غير التفاعلية ، حيث يمكن أن تؤدي الإزالة السريعة إلى إتلاف الهيدروجيل.
   9. ضع الركيزة في طبق بتري مقاس 60 مم × 15 مم في وسائط الاستزراع المحددة. هنا ، تم استخدام وسائط ATGN المكملة ب 100 ميكروغرام / مل سبيكتينومايسين ل B. subtilis أو 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين للإشريكية القولونية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة من أوقات الاستزراع.

7. إعداد المواد لاستخراج الخلايا

1. PDMS (Polydimethylsiloxane) التحضير
   1. قم بلصق كومة من عشرة أغطية مقاس 18 × 18 مم معا وألصق هذه المجموعة من الأغطية في قاع طبق بتري.
   2. لتصنيع حوامل PDMS ، امزج سلائف PDMS وعامل المعالجة بنسبة حجم 10: 1 في كوب بلاستيكي ، وقم بنزع الخليط في مجفف فراغ ، ثم صب الخليط في طبق بتري.
   3. علاج PDMS لمدة 90 دقيقة عند 80 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بقص حول الكتلة المسجلة لإزالة حامل PDMS ووضع حامل PDMS على شريحة زجاجية لتسهيل التعامل معها للفحص المجهري.
2. تحضير الحقن الدقيقة والأنابيب
   1. قم بقطع 20 سم من أنابيب PTFE (بولي تترافلورو إيثيلين) (0.05 بوصة من المعرف) وقم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب بحقنة ميكرولتر سعة 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: للاستخراج، تجنب استخدام الماصات لأن سحب الخلايا التي تم إطلاقها عبر طرف الماصة يمكن أن يتلف سطح الهيدروجيل ويؤدي إلى التلوث.

8. تدهور الهيدروجيل مع أداة الإضاءة المزخرفة

1. قم بتشغيل المجهر (انظر جدول المواد). بعد ذلك، قم بتشغيل أداة الإضاءة المزخرفة (انظر جدول المواد).
2. قم بتشغيل وحدة التحكم التناظرية والرقمية لمصدر ضوء LED 365 نانومتر. بعد ذلك ، قم بتشغيل وحدة التحكم في مصدر ضوء LED.
3. افتح برنامج المجهر وبرنامج أداة الإضاءة المزخرفة. عند فتح نافذة تكوين الأجهزة، حدد الزر تحميل.
   ملاحظة: سيتم تحميل ثلاثة أجهزة هنا. (كاميرا تابعة لجهة خارجية ووحدة تحكم وأداة إضاءة منقوشة)
4. اضغط على زر ابدأ. سيتم الآن فتح نافذة برنامج الزخرفة الخفيفة. حدد الخيار الأول ، زر التحكم في الجهاز ، على الشريط الجانبي الأيسر من النافذة.
5. معايرة أداة الإضاءة المزخرفة.
   ملاحظة: يجب أن تتم المعايرة بنفس هدف المجهر والمرشح الذي سيتم استخدامه للتعرض للضوء.
   1. اضبط هدف المجهر على تكبير 10x.
      ملاحظة: يسمح هذا التكبير بمسافة عمل كافية بين عدسة المجهر وسطح العينة. كما يسمح بمراقبة وتسجيل عملية الاسترجاع في الوقت الفعلي من خلال نافذة الصورة.
   2. اضبط عدسة المجهر والفلتر على الإعدادات المستخدمة للتعرض للضوء وضع مرآة المعايرة تحت المجهر.
   3. في نافذة التحكم في الجهاز، اضغط على علامة التبويب LED Control. قم بتشغيل LED # 1 واضبط شدة الضوء على الرقم المطلوب. في تجارب الاستخراج القياسية ، يتم تعيين هذا على 60٪.
   4. اضغط على علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المزخرفة في نافذة التحكم في الجهاز. ثم اضغط على إظهار الشبكة زر.
      ملاحظة: سيتم عرض نمط شبكة على مرآة المعايرة.
   5. اضبط تركيز المجهر وتعريض الكاميرا للحصول على جودة صورة عالية للشبكة وقم بتدوير الكاميرا لمحاذاة خطوط الشبكة بالتوازي مع إطار نافذة الكاميرا، إذا لزم الأمر.
   6. حدد الزر معالج المعايرة أسفل علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المزخرفة، واتبع الإرشادات التي يوفرها البرنامج في هذه النافذة. ملاحظة: سيتم فتح نافذة إعداد الكاميرا التابعة لجهة خارجية.
   7. سيتم فتح نافذة تحديد نوع المعايرة. حدد المعايرة التلقائية واضغط على التالي.
   8. عند فتح نافذة ضبط المعايرة المسبقة، اتبع تعليمات البرنامج واضغط على الزر التالي.
   9. عند فتح نافذة معلومات التعيين، احفظ هذه المعايرة وفقا لذلك في المجلد المطلوب. يتم ذلك عن طريق وضع التاريخ واسم المجهر والعدسة الموضوعية والفلتر.
   10. بعد المعايرة ، اضغط على زر تعريف منطقة العمل الموجود أسفل علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المزخرفة لتحديد منطقة العمل لأداة الإضاءة المزخرفة إذا لزم الأمر.
6. قسم تصميم التسلسل لإعداد النمط.
   1. اضغط على الزر Sequence Design الموجود على الشريط الجانبي الأيسر من نافذة البرنامج. ثم اضغط على محرر تسلسل الملف الشخصي زر.
   2. عند فتح نافذة محرر تسلسل ملف التعريف ، حدد خيار ملف تعريف جديد ضمن قائمة ملفات التعريف.
      ملاحظة: الآن ، سيتم فتح نافذة محرر النمط.
   3. قم بإعداد النمط المطلوب للتعرض للضوء عن طريق اختيار أشكال وأحجام أنماط مختلفة أو رسم النمط يدويا ، إذا رغبت في ذلك.
   4. بالنسبة للأنماط المتقاطعة الدائرية والمكسورة للهيدروجيل السائب ، اتبع الخطوات 8.6.5- 8.6.6
   5. بالنسبة لأنماط الدوائر ، حدد دائرة بقطر 30 ميكرومتر فوق مستعمرة بكتيرية مستهدفة لتغطية المستعمرة بأكملها. اختر لون تعبئة الشكل الأبيض.
   6. بالنسبة للأنماط المتقاطعة المكسورة ، اختر شكل المستطيل من نافذة رسم النمط بأبعاد 3 ميكرومتر × 8 ميكرومتر. ضع أربعة مستطيلات بهذه الأبعاد على حواف المستعمرة المستهدفة ، بينما تحتوي نصف الأنماط على تراكب مع المستعمرة.
   7. بالنسبة لأنماط الدائرة والحلقة لمصفوفات microwell ، اتبع الخطوات 8.6.8-8.6.10.
   8. بالنسبة لأنماط الدائرة ، ارسم دائرة قطرها 10 ميكرومتر حول محيط البئر. اختر لون تعبئة الشكل الأبيض.
   9. بالنسبة لنمط الحلقة ، ارسم دائرة بقطر 20 ميكرومتر ، وضعها فوق البئر واختر لون تعبئة الشكل الأبيض.
   10. ارسم نمط دائرة آخر بقطر 10 ميكرومتر بلون شكل تعبئة أسود وضعه حول محيط البئر.
7. قم بتحرير النمط وتعديل الأشكال بناء على طريقة الاستخراج المطلوبة. تأكد من وجود النمط المطلوب داخل منطقة عمل أداة الإضاءة المزخرفة.
8. ضع العينة في حامل PDMS وقم بماصة الوسائط المحددة أعلى العينة لمنع جفاف العينة وتوفير محلول حامل للخلايا التي تم تحريرها.
9. ثم استبدل هذا بمرآة المعايرة.
10. اضبط تركيز المجهر للحصول على صورة حادة للمستعمرات داخل الهيدروجيل. افحص المستعمرات لتحديد مستعمرة ذات أهمية.
11. هنا ، صمم أنماط الضوء بينما يظهر عرض الكاميرا المستعمرات داخل العينة لاختبار أنماط مختلفة لاستخراج الخلايا.
12. احفظ النمط المحدد. بعد حفظ النمط المحدد، حدد قسم التحكم في الجلسة.
13. في هذا القسم ، ضمن علامة التبويب التي تحمل اسم منتج أداة الإضاءة المزخرفة ، أضف التسلسل المحفوظ.
14. بعد إضافة التسلسل ، حدد خيار محاكاة النمط لعرض وضبط موقع التعرض المطلوب.
    ملاحظة: يمكن تعديل موقع العينة هنا لضمان عرض النمط بدقة في المنطقة المستهدفة.
15. بعد ذلك ، اضبط شدة الضوء على 60٪ ووقت التعرض إلى 40 ثانية أسفل علامة التبويب التحكم LED وابدأ عملية التعرض.
16. راقب تدهور الهيدروجيل في الوقت الفعلي ووضع المجال الساطع لضمان إطلاق الخلية.
    ملاحظة: منع أي حركات للعينة أثناء التعرض للضوء لأنها يمكن أن تتسبب في تدهور المناطق غير المرغوب فيها من الهيدروجيل مما يؤدي إلى التلوث المتبادل.

9. استرجاع الخلايا

1. بعد التعرض للضوء بمقدار 365 نانومتر وإطلاق الخلايا ، يتم جمع الخلايا باستخدام حقنة ميكرولتر وأنابيب موائع دقيقة (الشكل 2).
   ملاحظة: يجب أن يتم استرجاع الخلايا فور التعرض للنمط. يسمح ذلك باستعادة الخلايا الموضعية قبل أن تبتعد الخلايا المنبعثة عن المنطقة المشععة.
2. قم بتغيير المجهر من الحقل الساطع إلى مرشح FITC أو TRITC للسماح بتصور المنطقة المكشوفة للعينة بالعين المجردة.
3. بمجرد تحديد موقع المنطقة المكشوفة ، ضع نهاية الأنبوب على البقعة المشععة. بعد ذلك ، قم بتغيير مرشح المجهر مرة أخرى إلى الحقل الساطع لمراقبة استرجاع الخلايا في الوقت الفعلي.
4. استخدم المحقنة المرفقة بالطرف الآخر من الأنبوب لسحب الخلايا التي تم تحريرها بعناية. اسحب 200 ميكرولتر من المحلول وأدخل المحلول في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل لتحليل الحمض النووي أو الطلاء.

Results

الشكل 1: تكوين هيدروجيل على أغطية زجاجية مثولة. (أ) توضع الفواصل التي يبلغ سمكها 12.7 ميكرومتر على جانبين متقابلين من غطاء قاعدة يحتوي على مجموعات ثيول تفاعلية. (ب) يتم سحب محلول سلائف الهيدروجيل فوق شريحة زجاجية غير متفاعلة ومفلورة. (ج) يتم...

Materials