القياس الكمي للألجينات البكتيرية باستخدام مقايسة حمض اليورونيك كاربازول

الملخص

المصدر: الأحمر ، ر. ، وآخرون. ثقافة متغير مستعمرة صغيرة من Pseudomonas aeruginosa وكمية الجينات. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو مقايسة لونية لقياس كمية الألجينات التي تنتجها Pseudomonas aeruginosa ، باستخدام الكاربازول للكشف عن أحماض اليورونيك بعد التحلل المائي للحمض. تتيح هذه الطريقة التحليل المقارن لإنتاج الجينات الطبيعي إلى الكتلة الحيوية البكتيرية في البحوث والدراسات السريرية.

البروتوكول

1. فحص حمض اليورونيك كاربازول

1. حدد مستعمرة واحدة من مزرعة نقية للسلالة المطلوبة المراد اختبارها. باستخدام عود أسنان معقم، اختر المستعمرة وضع عود الأسنان في أنبوب اختبار مزرعة يحتوي على 5 مل من مرق عزل الزائفة (PIB). تنمو في حاضنة شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   ملاحظه: السلالات التالية ، PAO581 (PAO1mucA25) ، PAO581carA ، PAO581carB ، و PAO581pyrD ، نمت على ألواح PIA (Pseudomonas isolation agar) أو ألواح PIA المكملة ب 0.1 ملي مولار يوراسيل لحصاد ألجينات للقياس.
2. على لوحة PIA المسخنة مسبقا ، أضف 150 ميكرولتر من مرق PIB المزروع (لألواح 15 مم × 100 مم) أو 450 ميكرولتر من المرق (لألواح 15 مم × 150 مم). باستخدام موزع خلية معقم ، انشر المرق على الطبق. قم بزراعة الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
   ملاحظه: استنشق أي سائل زائد، إن وجد، من اللوحة باستخدام ماصة عن طريق قلب اللوحة إلى جانب واحد. تحتوي كل من لوحات PIB و PIA المستخدمة في البروتوكول على 20 مل / لتر من الجلسرين ، والتي تستخدمها الخلايا كمصدر للكربون للمساعدة في إنتاج الألجينات.
3. باستخدام وحدة تحكم في الماصة وماصة معقمة سعة 50 مل ، أضف 0.85٪ كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) إلى العشب المزروع واجمع العينة عن طريق كشط اللوحة باستخدام موزع الخلية. اسحب العينة باستخدام ماصة جديدة سعة 50 مل في أنبوب تجميع سعة 50 مل. دوامة العينة على ارتفاع لخلط العينات ووضعها على الثلج.
   ملاحظه: يختلف حجم كلوريد الصوديوم المضاف بنسبة 0.85٪ حسب حجم اللوحة. بالنسبة للألواح مقاس 15 مم × 100 مم ، استخدم 10-30 مل ، وبالنسبة لألواح 15 مم × 150 مم ، استخدم 20-50 مل.
4. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) من العينات عن طريق إضافة 1 مل من العينة إلى كوفيت يمكن التخلص منه وقراءة OD باستخدام مقياس الطيف الضوئي. كرر هذه الخطوة 2x للحصول على ثلاث نسخ من القراءات لكل عينة.
5. أضف 3 مل من محلول حامض الكبريتيك / البورات إلى أنابيب الاستزراع واتركه على الثلج. أضف 350 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها ببطء إلى مزيج الحمض في أنابيب الاختبار والدوامة على نار منخفضة لفترة وجيزة.
   1. قم بإعداد مخزون البورات بإضافة 10.099 جم من مسحوق هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH) إلى 45 مل من الماء. أضف 24.74 جم من حمض البوريك (H₃BO₃) إلى الخليط وارفع الحجم إلى 100 مل.
   2. ضع زجاجة سعة 1 لتر في حوض به ثلج واملأها ب 500 مل من حمض الكبريتيك المركز. أضف ببطء 15 مل من مخزون البورات المحضر. دع الزجاجة تبرد.
   3. أضف 10 مل أخرى من مخزون البورات ليصبح المجموع 25 مل. بمجرد أن تبرد الزجاجة ، ارفع الحجم إلى 1 لتر.
      أنذر: تعتمد هذه الطريقة على استخدام حامض الكبريتيك عالي التركيز. يجب استخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة لضمان السلامة ، ويجب اتباع بروتوكول التخلص المناسب للعينة.
      ملاحظه: من أجل التحكم الإيجابي ، يتم حصاد وتنقية تركيز معروف من حمض D-mannuronic و / أو عينة ألجينات بكتيرية معروفة وتنقيتها من خلال سلالات منتجة للألجينات من P. aeruginosa (على سبيل المثال ، PAO581-PAO1mucA25). للتحكم السلبي ، استخدم محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.85٪ و / أو PAO1ΔalgD (الحذف داخل الإطار لجين algD الذي يجعل البكتيريا غير قادرة تماما على إنتاج الجينات). يمكن عمل أنابيب متعددة من كل عينة لزيادة عدد التكرارات الفنية للمساعدة في التحليل الإحصائي. قم بإعداد 3-5 أنابيب من كل عينة.
6. أضف 100 ميكرولتر من 0.1٪ كاربازول في محلول الإيثانول إلى مزيج الحمض / العينة. قم بتغطية الأنبوب والدوامة على إعداد متوسط لمدة 5 ثوان. ضعه في حمام جاف عند 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
7. بعد الحضانة ، قم بإزالة الأنابيب والدوامة لفترة وجيزة على ارتفاع واتركها لتبرد لمدة 5 دقائق.
   ملاحظه: سيكون اللون الذي يمكن رؤيته ظلا من اللون الأرجواني. سيظل اللون مستقرا للقياس لمدة 1-2 ساعة.
8. اقرأ OD₅₃₀ لكل أنبوب عن طريق إضافة 1 مل من الخليط إلى كوفيت نظيف وقراءة OD للعينات عند 530 نانومتر على مقياس الطيف الضوئي. استخدم الأنبوب الذي يحتوي على 0.85٪ كلوريد الصوديوم كفراغ في مقياس الطيف الضوئي.
9. قم بإعداد منحنى قياسي عن طريق قياس OD₅₃₀ من التخفيفات التسلسلية للتركيزات المعروفة لحمض D-Mannuronic (1،024 ميكروغرام / مل ، 512 ميكروغرام / مل ، 256 ميكروغرام / مل ، 128 ميكروغرام / مل ، 64 ميكروغرام / مل ، 32 ميكروغرام / مل ، 16 ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل). كرر 2x. استخرج معادلة خطية من هذه القراءات.
   ملاحظه: يجب أن يتم المنحنى القياسي مرة واحدة فقط. يمكن استخدام المعادلة الخطية المستخرجة منها للاختبار لاحقا.
   1. احسب تركيز الجينات في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي واقسم تركيز الجينات من المعادلة الخطية على OD₆₀₀ للحصول على الكمية الإجمالية للجينات لكل OD₆₀₀.

المواد