$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ELISA لكمية الجينات
1. باستخدام ماصة دقيقة ، أضف 50 ميكرولتر من العينة التي تم جمعها إلى صفيحة غير معالجة مكونة من 96 بئرا. أضف 50 ميكرولتر من عازلة الطلاء (درجة الحموضة العازلة للكربونات / البيكربونات 9.6) إلى الآبار. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
ملاحظه: من أجل التحكم الإيجابي ، يمكن استخدام تركيز معروف من حمض D-Mannuronic و / أو سلالة منتجة مستقرة معروفة لإنتاج الألجينات (مثل PAO581-PAO1 mucA25). للتحكم السلبي ، استخدم محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.85٪ و / أو PAO1ΔalgD (الحذف داخل الإطار لجين algD يجعل البكتيريا غير قادرة تماما على إنتاج أي ألجينات). يمكن صنع آبار متعددة من كل عينة لزيادة عدد التكرارات الفنية للمساعدة في التحليل الإحصائي. تحضير 3-5 آبار من كل عينة.
2. باستخدام زجاجة بخ ، اغسل آبار الطبق 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 0.05٪ توين 20 (PBS-T) عن طريق ملء الآبار ، ثم تصريفها عن طريق قلب اللوحة.
3. باستخدام الماصة الدقيقة ، أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت (10٪ حليب خالي الدسم في PBS-T) إلى الآبار. احتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
ملاحظه: لف الطبق بغشاء بارافين أو غلاف تقليص للمساعدة في تجنب أي تبخر في الثلاجة.
4. باستخدام زجاجة بخ ، اغسل آبار الطبق 2x باستخدام PBS-T عن طريق ملء الآبار ، ثم تجفيفها عن طريق قلب اللوحة.
5. باستخدام الماصة الدقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي المخفف (الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفأر) إلى الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
ملاحظه: تم توفير الجسم المضاد الأولي (الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للألجينات للفأر) بتركيز 0.5 ميكروغرام / مل (تخفيف 1: 2,000 من مخزون 1 مجم / مل) في محلول مخفف للأجسام المضادة (1٪ حليب خالي الدسم في 1x PBS).
6. باستخدام زجاجة بخ ، اغسل آبار الطبق 3x باستخدام PBS-T عن طريق ملء الآبار ، ثم تجفيفها عن طريق قلب اللوحة.
7. باستخدام الماصة الدقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى الآبار واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعة.
ملاحظه: كان الجسم المضاد الثانوي المستخدم هو الجسم المضاد للبيروكسيداز متعدد الفجل (HRP) المضاد للفأر بتركيز 0.25 ميكروغرام / مل (تخفيف 1: 2,000 من مخزون 0.5 مجم / مل) في محلول مخفف للأجسام المضادة.
8. باستخدام زجاجة بخ ، اغسل آبار الطبق 3x باستخدام PBS-T عن طريق ملء الآبار ، ثم تجفيفها عن طريق قلب الطبق.
9. باستخدام ماصة دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول TMB (3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine) -ELISA (مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم) (جدول المواد) واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام.
ملاحظه: سيكون لون رد الفعل الإيجابي ظلا من اللون الأزرق.
10. باستخدام الماصة الدقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من محلول الإيقاف (2 نيوتن حمض الكبريتيك).
ملاحظه: سيتحول اللون من الأزرق إلى الأصفر عند إضافة محلول التوقف. اللون مستقر لمدة تصل إلى 30 دقيقة بعد توقف التفاعل.
11. باستخدام قارئ اللوحة ، اقرأ OD عند 450 نانومتر.
12. أنتج منحنى قياسيا عن طريق قياس OD450 من التخفيفات التسلسلية للتركيزات المعروفة لحمض D-Mannuronic (1،024 ميكروغرام / مل ، 512 ميكروغرام / مل ، 256 ميكروغرام / مل ، 128 ميكروغرام / مل ، 64 ميكروغرام / مل ، 32 ميكروغرام / مل ، 16 ميكروغرام / مل ، و 8 ميكروغرام / مل). كرر 2x. من هذه القراءات ، استخرج معادلة خطية.
ملاحظه: يجب أن يتم المنحنى القياسي مرة واحدة فقط. يمكن استخدام المعادلة الخطية المستخرجة منها للاختبار لاحقا.
1. احسب تركيز الجينات في كل عينة باستخدام المنحنى القياسي واقسم تركيز الجينات من المعادلة الخطية على OD600 للحصول على الكمية الإجمالية للجينات لكل OD600.