نمذجة استعمار الفئران المهبلي بواسطة البكتيريا اللاهوائية

الملخص

المصدر: Morrill, S. R., et al. نماذج من الاستعمار المهبلي الفئران بواسطة البكتيريا المزروعة اللاهوائية. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو بروتوكولا لنمذجة الاستعمار المهبلي في الفئران باستخدام البكتيريا اللاهوائية المقاومة للمضادات الحيوية. يبدأ بالعلاج الهرموني لزيادة القابلية للإصابة الظهارية ، يليه التلقيح المهبلي والتلقيح المشترك في ظل ظروف لاهوائية. يختتم الإجراء بأخذ عينات ما بعد التلقيح والثقافة لتقييم الاستعمار البكتيري وتكوين الأغشية الحيوية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تحضير اللقاح

ملاحظه: يحتوي هذا القسم على الخطوات العامة لتحضير اللقاح من Gardnerella vaginalis المزروعة اللاهوائية المقاومة للستربتومايسين JCP8151B-SmR. يجب أن تتم جميع الخطوات في هذا القسم في غرفة لاهوائية.

1. قم بتدوير أي كواشف ، بما في ذلك مرق مدينة نيويورك الثالث (NYCIII) ، والأجار ، والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) ، في غرفة لاهوائية لتحقيق التوازن لمدة 24 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
   ملاحظه: هنا ، تم استخدام غرفة لاهوائية من الفينيل متوازنة بمزيج غاز الهيدروجين بنسبة 5٪. عادة ما يكون تركيز الأكسجين الداخلي عند 0 جزء في المليون ، على الرغم من أنه يمكن أن تكون هناك زيادات عابرة منخفضة المستوى (10-25 جزء في المليون) عند تدوير المواد إلى الغرفة.
2. قبل يومين من التلقيح المهبلي ، قم بإخراج Gardnerella من مخزون الجلسرين المجمد على لوحة أجار NYC III في الغرفة اللاهوائية. استخدم وعاءا صغيرا (مثل صندوق طرف ماصة فارغ) مملوءا بالثلج الجاف للحفاظ على مخزون الجلسرين مجمدا أثناء النقل داخل الغرفة وخارجها.
3. قبل يوم واحد من التلقيح المهبلي ، استخدم 5-10 مستعمرات Gardnerella فردية من الطبق لتلقيح 10 مل من مرق مدينة نيويورك III. اترك المزرعة السائلة تنمو طوال الليل لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. قم بتضمين 1 مل ثانية من وسط الاستزراع الذي يترك غير ملقح واحتضنه جنبا إلى جنب مع المزرعة الملقحة للتأكد من أن الوسط غير ملوث.
4. تحضير اللقاح من الثقافة السائلة كما هو موضح أدناه. قم بإجراء تحضير اللقاح في الغرفة اللاهوائية قدر الإمكان.
   1. حدد الكثافة الضوئية للثقافة (OD) بإضافة 200 ميكرولتر من المزرعة إلى 800 ميكرولتر من الوسائط الطازجة في كوفيت 1.5 مل (تخفيف 1: 5). استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس كثافة (OD) للثقافة المخففة بطول موجي يبلغ 600 نانومتر (استخدم كوفيت منفصل مع وسائط جديدة وحدها كفارغ). اضرب قراءة OD في 5 للحصول على OD₆₀₀ الفعلي من ثقافة 16 ساعة.
   2. احسب حجم اللقاح اللازم للتجربة. على سبيل المثال ، لإصابة 15 فأرا بلقاح 20 ميكرولتر لكل فأر ، هناك حاجة إلى 15 × 20 ميكرولتر = 300 ميكرولتر من اللقاح. قم بإعداد لقاح أكثر بنسبة 25٪ تقريبا من المطلوب ، لذلك بالنسبة ل 15 فأرا ، قم بإعداد 300 ميكرولتر + (0.25 × 300 ميكرولتر) = 375 ميكرولتر من اللقاح.
   3. باستخدام OD₆₀₀ المحدد في الخطوة 1.4.1 ، احسب حجم مزرعة 16 ساعة التي يجب تدويرها وإعادة تعليقها للحصول على تلقيح OD₆₀₀ = 5.0 في الحجم المحسوب في الخطوة 1.4.2. على سبيل المثال ، إذا كان OD₆₀₀ للثقافة هو 1.5 ، وكان حجم اللقاح المطلوب 375 ميكرولتر ، فإن حجم المزرعة المراد نسجها هو (375 ميكرولتر × 5) / 1.5 = 1250 ميكرولتر.
   4. ماصة حجم الثقافة المحسوبة في الخطوة 1.4.3. في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. قم بإزالة البكتيريا بالطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 1-3 دقائق.
   5. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في PBS اللاهوائي بالحجم المحسوب في الخطوة 1.4.2. سيكون اللقاح الآن عند OD₆₀₀ محسوب من 5.0. إذا كان ذلك ممكنا ، قم أيضا بإعداد أنبوب من PBS ليكون بمثابة وسيلة تحكم للفئران في مجموعة التحكم غير المصابة.
5. قبل إزالة أنبوب التلقيح من الغرفة اللاهوائية ، قم بإعداد سلسلة تخفيف تسلسلي من 1:10 إلى 1:10 ×^{10 6} في برنامج تلفزيوني. تكرر اللوحة الموضعية 5 من كل تخفيف على لوحة أجار باستخدام ماصة متعددة القنوات لتحديد وحدات تشكيل المستعمرة أو CFU لللقاح. هذا هو CFU قبل التلقيح.
6. غسل المهبل قبل الغسيل والتلقيح ب Gardnerella
   1. تحضير أنابيب الغسيل المهبلي / الغسيل في الغرفة اللاهوائية. ماصة 70 ميكرولتر من PBS المعقمة اللاهوائية في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وعليها أرقام الماوس. قم بإعداد أنبوب غسيل واحد لكل فأر. أغلق الأنابيب بإحكام وأخرجها من الغرفة اللاهوائية.
   2. قم بإجراء غسل مهبلي على كل فأر باستخدام 50 ميكرولتر من PBS اللاهوائي من الأنابيب الفردية المحضرة في الخطوة 2.1. هذه الغسل المهبلي هي غسول ما قبل التلقيح ويمكن استخدامها للقياسات والمقايسات النهائية.
      1. بعد إعطاء الحقن الثاني β استراديول فاليرات ، ضع كل فأر فوق قفص أو سطح نظيف وصلب يمكنه الإمساك به بمخالبه الأمامية. أمسك الجزء الأوسط من الذيل برفق وارفعه بحيث تكون الخلف مرتفعة قليلا وتتعرض فتحة المهبل.
      2. باستخدام ماصة وطرف مرشح p-200 ، اسحب 50 ميكرولتر من PBS من أنبوب الغسيل المقابل للماوس المناسب. أدخل طرف الماصة برفق في التجويف المهبلي ~ 2-3 مم، وقم بسحب حجم 50 ميكرولتر للداخل والخارج برفق، 3x-4x.
      3. انقل مادة الغسيل التي تم جمعها (~50 ميكرولتر) مرة أخرى إلى نفس أنبوب الغسيل الذي أتت منه، مع سحب الماصة لأعلى ولأسفل في أنبوب الغسيل الذي لا يزال يحتوي على 20 ميكرولتر المتبقية من PBS. إذا كان هناك مخاط مفرط وانسداد الطرف ، فاستخدم طرفا نظيفا من p200 لجمع المواد المتبقية ووضعها في نفس أنبوب الغسيل.
   3. يجب تطبيق 20 ميكرولتر من التعليق البكتيري المركز أو التحكم في السيارة في مهبل كل فأر عن طريق المهبل. قم بتلقيح كل فأر مباشرة بعد الغسيل المهبلي لهذا الفأر (أي إجراء الغسيل والتلقيح بالتسلسل لكل فأر قبل الانتقال إلى التالي). لتبسيط هذه العملية، استخدم ماصتين من نوع p200 - إحداهما مضبوطة على 50 ميكرولتر للغسيل والأخرى على 20 ميكرولتر للتلقيح.
      1. قم بتقييد الماوس كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. باستخدام طرف p-200 ، قم بإدخال 20 ميكرولتر من المعلق البكتيري في المهبل. لتجارب التلقيح المشترك باستخدام نوعين / سلالات بكتيرية مختلفة ، استخدم 10 ميكرولتر من كل معلق بكتيري وتجنب خلط السلالتين قبل التلقيح.
         ملاحظه: يجب ألا يتجاوز حجم التلقيح الإجمالي 20 ميكرولتر لتجنب الانتشار خارج المهبل.
      2. استمر في تثبيت الطرف الخلفي لكل فأر لمدة 10-20 ثانية لمنع الحجم المدار من التجمع على الفور في المهبل الداخلي. بعد ذلك ، ضع الفأر في قفص / وعاء جديد أو مع رفقاء القفص الذين تم تطعيمهم بالفعل.
      3. كرر الخطوة 2.2. والخطوة 2.3. لكل فأر. لا تضع الفئران مرة أخرى في قفص مع لم يتم تطعيمها بعد. هذا يمنع التعرض غير المقصود للفئران للبكتيريا المقاومة للستربتومايسين قبل التلقيح.
   4. بعد تلقيح جميع الفئران ، قم بتدوير أنبوب اللقاح مرة أخرى إلى الغرفة اللاهوائية. قم بإعداد وطلاء تخفيف تسلسلي آخر كما هو موضح في الخطوة 1.5. هذا هو CFU بعد التلقيح. قارن CFUs من لوحات ما بعد التلقيح وما قبل التلقيح لتحديد ما إذا كانت صلاحية اللقاح انخفضت أثناء الخروج من الغرفة اللاهوائية أثناء تلقيح.
   5. قم بغسل المهبل الذي تم جمعه في الخطوة 2.2. على أجار انتقائي (في هذه الحالة ، 1 مجم / مل ستربتومايسين). احتضان الصفائح لمدة 1-2 أيام في غرفة لاهوائية عند 37 درجة مئوية وفحص النمو. ملاحظة: يشير النمو إلى أن الأعضاء الداخلية المنشأ للميكروبيوم تقاوم علامة الاختيار ، وبالتالي قد تحجب تعداد CFU للكائن الحي المستهدف.
7. مجموعة من الغسيل المهبلي لتحديد استعمار Gardnerella القابل للحياة
   1. اجمعي الغسالات المهبلية في نقاط زمنية محددة لتحليل الاستعمار المهبلي. التجميع كما هو موضح في الخطوة 2.2.
   2. مباشرة بعد التجميع ، قم بتدوير الغسيل المهبلي في غرفة لاهوائية. استخدم 10 ميكرولتر من كل غسل لإجراء التخفيف التسلسلي والطلاء على أجار انتقائي كما هو موضح في الخطوة 1.5. استخدام CFU يعد كمقياس للاستعمار المهبلي بواسطة Gardnerella (أو اللاهوائي آخر من الأهمية).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
β-استراديول 17-فاليرات	سيغما	[إ1631]	هرمون الاستروجين للفئران
1x PBS	صياد	MT21040CM	غسل المهبل ، G. vaginlalis التحضير للتلقيح ، جمع الأنسجة والتجانس
الغرفة اللاهوائية	خجول	7200000	نمو البكتيريا اللاهوائية
باكتو أجار	صياد	DF0140074	G. المهبلية ، F. nucleatum ، و P. bivia ألواح أجار
الجلوكوز	سيغما	جي 7528	وسائط NYCIII لنمو G. المهبل
HEPES	سيلجرو	25-060-سي تي	وسائط NYCIII لنمو G. المهبل
مصل الحصان	هيموسات	ش.ش500	وسائط NYCIII لنمو G. المهبل
مزيج غاز الهيدروجين (5٪ هيدروجين ، 10٪ ثاني أكسيد الكربون ، 85٪ نيتروجين)	ماثيسون		غاز للغرفة اللاهوائية
جهاز تنقية المياه Milli-Q	ميليبور	معدل الذكاء -7000	لصنع الوسائط والتجانس
كلوريد الصوديوم	سيغما	ط3014	وسائط NYCIII لنمو G. المهبل
غاز النيتروجين	ايرغاز		غاز للغرفة اللاهوائية
نصائح مرشح P-200	مركز الدراسات الدولية السيرة الذاتية	ف-1237-200	غسل المهبل والتطعيمات البكتيرية
شيرج	صياد	ICN15662191	هرمون الاستروجين للفئران
مقياس الطيف الضوئي	بيوكروم	80-3000-45	قياس OD البكتيري ₆₀₀
الستربتومايسين	جيبكو	11860038	أضف إلى وسائط Agar لعمل لوحات انتقائية
مستخلص الخميرة	صياد	DF0127-17-9	وسائط NYCIII لنمو G. المهبل