التوصيل الموضعي للبكتيريا إلى تجويف الأمعاء ليرقة سمك الزرد باستخدام الحقن المجهري

الملخص

المصدر: Li, J. et al. تطوير نموذج عدوى يرقات الزرد ل Clostridioides difficile. J. Vis. خبرة. (2020)

يوضح هذا الفيديو التوصيل القائم على الحقن المجهري للمثية العسيرة المسمى بالفلورسنت في تجويف الأمعاء ليرقة سمك الزرد المخدرة. يحدد الخطوات التي ينطوي عليها تحضير اليرقات ، والحقن البكتيري ، والتأكيد المجهري الفلوري القائم على التوطين البكتيري داخل الأمعاء.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. حقن المطثية العسيرة الملطخة في يرقات الزرد

1. قم بتخدير 20-30 يرقة من أسماك الزرد بعد 5 أيام من الإخصاب (يشار إليها هنا باسم 5 نقطة في القدم ) مع 0.02٪ -0.04٪ تريكائين (يذوب مسحوق التريكايين في ماء مقطر مزدوج ويتم تعديله إلى درجة الحموضة = 7 مع محلول 1 M Tris-HCL) في 30٪ وسط دانيو ~ 10 دقائق قبل الحقن. انقل اليرقات المخدرة إلى طبق بتري طازج مقاس 10 سم وقم بإزالة أي زيادة بنسبة 30٪ من وسط دانيو.
2. ضع قطرة من الأغروز منخفض الذوبان بنسبة 0.8٪ على يرقات الزرد لتغطيتها. اضبط اليرقات برفق على وضع جانبي. ضع طبق بتري على الثلج لمدة 30-60 ثانية للسماح للأغاروز منخفض الذوبان بالتصلب. أضف 30٪ وسط دانيو يحتوي على 0.02٪ -0.04٪ تريكائين لتغطية الاغاروز.
3. تحضير محلول الحقن. أضف 1 ميكرولتر من 0.5٪ فينول أحمر في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) إلى 9 ميكرولتر من لقاح المطثية العسيرة الملطخ بالصبغة لتصور عملية الحقن.
4. قم بتحميل إبرة الحقن المجهري المعايرة بمحلول الحقن باستخدام محمل دقيق. قم بتركيب الإبرة المحملة على مناور دقيق وضعه تحت المجهر الفراغي.
5. اضبط ضغط الحقن بين 600-900 هكتوباسكال. ضبط زمن الحقن على 0.1-0.3 ثانية للحصول على 0.5-1.0 نانولتر. اضبط الإبرة في المعالج الدقيق بزاوية ~ 45 درجة تشير إلى اليرقات المدمجة.
6. ضع طرف الإبرة فوق الجهاز الهضمي ، بالقرب من المسام البولية التناسلية. اخترق الاغاروز ، ثم العضلة بطرف الإبرة ، ثم أدخلها في تجويف الأمعاء وحقن 0.5-1.0 نانومتر من المطثية العسيرة. استخدم مجهر مضان لمراقبة اليرقات المحقونة والتقاط اليرقات المحقونة بشكل صحيح للتصوير متحد البؤر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الاغاروز منخفض الذوبان (LM)	برونادىسا	8050	يتم استخدامه في ألواح الاغاروز
باكلايت الأحمر وصمة عار بكتيرية	ثيرمو فيشر العلمي	ب35001	صبغة الفلورسنت
زجاج شعري	جهاز هارفارد	30-0019	إبر الحقن
المطثية العسيرة			R20291 ، سلالة ريبوتايب 027 ، إنتاج TcdA + / TcdB + / CDT +
DMSO	كارل روث GmbH	أ 994
فيجي	منصة مفتوحة المصدر		معالجة الصور
حاقن صغير	إيبندورف	5253000017
مجهر متحد البؤر Leica SP8	لايكا
فينول أحمر	سيجما ألدريتش	ص 0290
التريكائين	سيجما ألدريتش	E10521