إحياء ونمو بكتيريا حمض اللاكتيك

الملخص

المصدر: Ayivi ، R. et al. ، زراعة ونمو وقابلية بكتيريا حمض اللاكتيك للحياة: منظور مراقبة الجودة. J. Vis. خبرة. (2022)

يوضح هذا الفيديو طريقة استعادة بكتيريا حمض اللاكتيك المجهدة على البارد من مخزون الجلسرين المجمد ، واستعادة قابلية البكتيريا للبقاء من خلال الحضانة اللاهوائية ، وعزل المستعمرات النشطة لتوسيع الثقافة.

البروتوكول

1. بروتوكول تنشيط ومراقبة جودة مزارع بكتيريا حمض اللاكتيك (LAB)

1. خذ مخزون الجلسرين المحضر من سلالات LAB (في أنابيب طرد مركزي سعة 2 مل) من الفريزر المنخفض للغاية -80 درجة مئوية ، ولا تدعها تذوب قبل الاستخدام.
2. قم بتنظيف وتطهير فتحة أنابيب الطرد المركزي بنسبة 70٪ كحول ، ودوامة برفق قبل الاستخدام.
3. ماصة حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من ثقافة LAB من أنابيب الطرد المركزي إلى أنابيب اختبار جديدة سعة 2 مل MRS (وسائط deMan و Rogosa و Sharpe).
4. دوامة برفق ، وقم بتصوير أنابيب الاختبار ، واحتضانها بشكل لاهوائي طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
5. خذ حوالي 500 ميكرولتر (0.5 مل) من الثقافات المزروعة بين عشية وضحاها من أنابيب اختبار MRS سعة 2 مل إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 7 مل ، دوامة ، واحتضنها بشكل لاهوائي طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
6. قم بتقييم النمو الميكروبي عن طريق قياس الكثافة البصرية (OD) أو نمو الثقافات عند 610 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية وتسجيل النتائج المقبولة بين 0.7 و 0.9.
7. قم بربط المزارع الليلية من أنابيب MRS سعة 7 مل على ألواح أجار MRS و MRCM-PYR (معدلة مقلية متوسطة بيروفات مثتثية) واحتضانها بشكل لاهوائي لمدة 72 ساعة عند 42 درجة مئوية.
8. يتم قطف المستعمرات المعزولة من ألواح الأجار ، ونقلها إلى أنابيب اختبار MRS جديدة سعة 7 مل ، ودوامة بلطف ، وتحضينها لاهوائية طوال الليل عند 42 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
9. قم بتخزين ألواح الأجار التي تحتوي على السلالات المعزولة عند 4 درجات مئوية في الثلاجة لمدة أسبوع.
10. قم بقياس وتأكيد OD (بين 0.7 و 0.9) من أنابيب اختبار MRS سعة 7 مل لمزارع LAB المعزولة من الألواح المخططة عند 610 نانومتر واستخدمها كثقافات عمل لجميع التجارب ذات الصلة.
11. للحصول على نسبة 1:10 ، قم بإجراء تخفيفات بعشرة أضعاف (تخفيفات متسلسلة) لمزارع LAB المزروعة من أنابيب اختبار MRS النهائية سعة 7 مل باستخدام 9 مل من ماء الببتون (مخزن مؤقت فسيولوجي).
12. أخيرا ، خذ حوالي 250 ميكرولتر (0.25 مل) من التخفيفات التسلسلية المناسبة لجميع تجارب التخمير.
13. قم بتنشيط المرق الذي يحتوي على سلالات (250 ميكرولتر) من الخطوة 2.12 عن طريق نقلها إلى مرق MRS طازج سعة 7 مل واحتضانها بشكل لاهوائي عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    ملاحظه: تم تنشيط جميع سلالات L. bulgaricus في مرق MRS المحضر حديثا ثم تم تحضينها بشكل لاهوائي عند 42 درجة مئوية لمدة 16 ساعة من أجل الوصول إلى كثافة بصرية (OD₆₁₀ نانومتر) من نمو البكتيريا بين 0.7 و 0.9. تم قياس نمو البكتيريا باستخدام مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية عند 610 نانومتر. كانت قيم الأس الهيدروجيني للمزارع الليلية في حدود 3.5 إلى 5.3 نتيجة لإنتاج حمض اللاكتيك ، وهو منتج نهائي عضوي لتخمير مختبر. تم الالتزام بإجراءات السلامة مثل الدوران السليم لتدفق الهواء في غطاء محرك السلامة الحيوية وتجنب الحروق أثناء استخدام موقد بنسن ومراعاتها.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أزرق أنيلين	ثيرمو ساينتفيك	راند 21526	25 جرام
مستخلص اللحم البقري	منتجات البحوث الدولية	50-197-7509	500 جرام
مستخلص الخميرة	فيشر العلمية	BP1422-500	500 جرام
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدرات	فيشر العلمية	سي 79-500	500 جرام
سكر العنب اللامائي	فيشر العلمية	BP350500	500 جرام
د-الفركتوز	أكروس أورجانيكس	AC161355000	500 جرام
مسحوق أجار ديفكو	ديفكو	DF0812-07-1	2 كجم
أجار TPY	ديفكو	211921	500 جرام
أنبوب الطرد المركزي الدقيق Eppendorf (قفل آمن لأجهزة الطرد المركزي الدقيقة ذات الغطاء المفاجئ)	فيشر العلمية	05-402-12	2 مل
الجلسرين	ثيرمو ساينتفيك	PI17904	500 مل
حاضنة ثاني أكسيد الكربون بالأشعة تحت الحمراء	فورما العلمية
ملبنة delbrueckii subsp. bulgaricus	مجموعة ثقافة النوع الأمريكي (ATCC)	ATCC 11842
ملبنة delbrueckii subsp. bulgaricus	بلغاريا	س9
ملبنة delbrueckii subsp. bulgaricus	بلغاريا	رطل 6
ملبنة delbrueckii subsp. bulgaricus	مختبر الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية للأغذية (NCATSU)	داو
ملبنة delbrueckii subsp. bulgaricus	مختبر الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية للأغذية (NCATSU)	ه 22
ملبنة ريوتيري	بيوجاي ، رالي / مختبر الأحياء الدقيقة والتكنولوجيا الحيوية للأغذية (NCATSU)	RD2
لام-سيستين هيدروكلوريد مونوهيدرات	سيجما ألدريتش	C6852-25G	25 جرام
المالتوز مونوهيدرات	فيشر العلمية	إم 75-100	100 جرام
مرق السيدة	نيوجين	50-201-5691	5 كجم
الببتون رقم 3	هاش	50-199-6719	500 جرام
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K₂HPO₄)	منتجات البحوث الدولية	50-712-761	500 جرام
أسيتات الصوديوم ثلاثي الهيدرات	فيشر العلمية	س 220-1	1 كجم
كلوريد الصوديوم	فيشر العلمية	BP358-1	1 كجم
بيروفات الصوديوم	فيشر العلمية	BP356-100	100 جرام
أنابيب اختبار مع أغطية لولبية مبطنة بالمطاط	فيشر العلمية	FB70125150	25 × 150 مم
توين 80	فيشر العلمية	تي 164-500	500 مل
فريزر منخفض للغاية	منخفض جدا
يوراسيل	أكروس أورجانيكس	AC157301000	100 جرام
مقياس الطيف الضوئي المرئي للأشعة فوق البنفسجية	ثيرمو فيشر العلمي	تطور 201
دوامة الجني 2	فيشر العلمية
مستخلص الخميرة	فيشر العلمية	BP1422-500	500 جرام
ايثانول	فيشر العلمية	T08204K7	4 لتر
حمض الهيدروكلوريك (6N (معتمد) ، فيشر كيميكيال)	فيشر العلمية	س 56-500	500 مل