$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. تلقيح مصفوفات البوليمر الدقيقة بالبكتيريا
ملاحظه: تأكد من تقنية التعقيم الجيدة. يجب إجراء جميع عمليات التعامل مع الثقافات في بيئة معقمة: إما باستخدام موقد بنسن أو في غطاء التدفق. يجب زراعة الثقافات مع توافر الأكسجين ووسط النمو ودرجة الحرارة المعدلة وفقا لمتطلبات كل نوع.
- قم بإعداد الثقافات الليلية عن طريق تلقيح 5 مل من مرق Luria-Bertani (رطل: 10 جم / لتر باكتو تريبتون ، 5 جم / لتر كلوريد الصوديوم ، كلوريد الصوديوم ، و 10 جم / لتر من مستخلص الخميرة) بمستعمرة من طبق. احتضان طوال الليل عند 37 درجة مئوية ، واهتز عند 200 دورة في الدقيقة (دورات في الدقيقة).
- قم بإعداد مخزون الفريزر من المزارع الليلية عن طريق إضافة الجلسرين (تركيز 10٪ بشكل عام) وتخزين المرق في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- من أجل تحديد أعداد الخلايا من عينات المخزونات البكتيرية المذابة ، قم بإجراء تخفيفات متسلسلة لكل مخزون وقم بزراعة البكتيريا بين عشية وضحاها على الوسائط الصلبة. يضمن التحديد الدقيق لأعداد الخلايا في المخزونات التلقيح المناسب لكل نوع.
- تحضير اللقاح للمصفوفة الدقيقة. تزرع الثقافات أحادية النوع على النحو الوارد أعلاه وتطبق مباشرة على المصفوفات الدقيقة. BacMix-1 هو خليط بكتيري من Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) ، المكورات العنقودية الرئامية (S. saprophyticus) ، والمكورات العنقودية الذهبية (S. aureus). BacMix-2 عبارة عن خليط بكتيري يتكون من المكورات العقدية الطافرة (S. mutans) ، و S. aureus ، و K. pneumoniae ، و Enterococcus feecalis (E. faecalis).
- لإنتاج أي من المزرعة المختلطة ، اخلطي اللمعان بأحجام متساوية (3 مل لكل منهما) وخففيها أربع مرات ب LB طازج (إلى حوالي 50 مل من الحجم النهائي).
- ضع مصفوفات البوليمر الدقيقة المعقمة بالأشعة فوق البنفسجية في ألواح مستطيلة مكونة من 4 آبار واحتضنها ب 6 مل من المزارع البكتيرية المختلطة عند 37 درجة مئوية مع تحريك لطيف (30 دورة في الدقيقة) لمدة 5 أيام.
- بعد الحضانة ، اشطف المصفوفات الدقيقة برفق مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS: 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، 10 ملي فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم ، Na2HPO4 ، 1.8 ملي فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم ، KH2PO4) واحتضان بمحلول 1 ميكروغرام / مل من صبغة 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) في PBS لمدة 30 دقيقة.
- اغسل شرائح المصفوفات الدقيقة الملطخة في صفيحة بئر جديدة عن طريق تغطيتها ب PBS وتحريكها برفق ، وتغيير PBS مرة واحدة. يجف تحت تدفق الهواء. ضع غطاء زجاجي على شريحة المصفوفة الدقيقة وأغلقها في مكانها بالغراء. بمجرد أن يجف ، قم بتعقيم السطح الخارجي ب 70٪ (حجم / حجم) إيثانول.
- تخلص من الثقافات بأمان وفقا لمستوى احتوائها.
2. تصوير وتحليل المصفوفات الدقيقة
- التقط صورا فردية لكل بقعة بوليمر في قنوات المجال الساطع و DAPI (الإثارة / الانبعاث ، Ex / Em = 358 نانومتر / 361 نانومتر). قم بإجراء ذلك يدويا باستخدام مجهر الفلورسنت أو باستخدام مجهر مضان آلي (مع مرحلة XYZ يتم التحكم فيها بواسطة برنامج الحصول على الصور) مزود بهدف 20X.
ملاحظه: اضبط المجهر للحصول على الصور باستخدام قنوات الحقل الساطع و DAPI. تأكد من أن وقت الكسب والتعرض لالتقاط الصور لجميع المصفوفات الدقيقة متماثلان. - احصل على متوسط شدة التألق لكل بقعة في قناة DAPI عن طريق اختيار المنطقة الموضعية وتحديد التألق باستخدام برنامج معالجة الصور.
- من أجل مضان الخلفية لكل بقعة ، احصل على صور لبقع البوليمر على مصفوفة دقيقة مكررة محتضنة فقط بوسائط خالية من البكتيريا. خصم مضان الخلفية من شدة البقعة للحصول على مضان من البكتيريا.
- احسب متوسط القيمة الطبيعية من البقع الأربع ، التي تمثل كل بوليمر ، المستخدمة لمقارنة ارتباط البكتيريا بالبوليمرات المختلفة.
- حدد البوليمرات التي تظهر أقل ارتباط بكتيري (أقل مضان) على أنها بوليمرات "ضربة".