تحضير لقاح الإشريكية القولونية النزفية بيولوجيا

الملخص

المصدر: Kuo, C., et al. الكشف عن استعمار الإشريكية القولونية النزفية المعوية في مضيف الفئران عن طريق نظام التلألؤ البيولوجي غير الغازي في الجسم الحي . J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو تحضير معلق الإشريكية القولونية النزفي المعوي العابر عن لوسيفيراز من المخزون المجمد لاستخدامه كلقاح فموي في النماذج الحيوانية. يتيح ذلك تتبع الاستعمار المعوي في الوقت الفعلي أثناء دراسات العدوى في الجسم الحي.

البروتوكول

1. تحضير بكتيريا EHEC ( الإشريكية القولونية النزفية المعوية) للتلقيح عن طريق الفم

ملاحظه: يتم عرض المخطط الانسيابي للجدول الزمني للإجراءات التجريبية لتحضير EHEC وتزقيم الفم للفئران في الشكل 1 للمساعدة في التحضير التجريبي.

1. سلسلة بكتيريا الإشريكية القولونية O157: H7 EDL933 التي تؤوي بلازميد لوسيفيراز على صفيحة أجار LB (Luria-Bertani) مع 50 ميكروغرام / مل كانامايسين من مخزون -80 درجة مئوية. تنمو البكتيريا لمدة 16 - 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
2. اختر مستعمرة واحدة من اللوحة الليلية والمزرعة في وسط 3 مل رطل مع 50 ميكروغرام / مل كانامايسين لمدة 16-18 ساعة في حاضنة 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة.
3. زراعة البكتيريا (تخفيف 1: 100) في كانامايسين (50 ميكروغرام / مل) - يحتوي على مرق LB لمدة 2.5 - 3 ساعات في حاضنة 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة. (على سبيل المثال ، أضف 2 مل من البكتيريا المستنبتة بين عشية وضحاها إلى 200 مل من وسط LB مع الكانامايسين (50 ميكروغرام / مل) مكمل.)
4. احتضن البكتيريا لمدة 2.5 - 3 ساعات وقم بقياس قيمة الكثافة البصرية (OD) عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) حتى تتراوح القيمة بين 0.9 إلى 1. يبلغ عدد الخلايا البكتيرية كثافة حوالي 10⁸ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل.
5. قم بالطرد المركزي للبكتيريا المعاد زراعتها عند 8,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية.
6. تخلص من المادة الطافية دون تحريك حبيبات البكتيريا, واغسل الحبيبات ب 100 مل 0.9٪ محلول ملحي عادي معقم عن طريق التحريك اللطيف.
7. كرر الخطوتين 1.5 و1.6 مرة واحدة.
8. بعد الغسيل ، قم بالطرد المركزي للثقافة البكتيرية عند 8,000 × جم لمدة 30 دقيقة ، 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية برفق.
9. قم بتكثيف الحبيبات 100 ضعف مع محلول ملحي عادي معقم 0.9٪. على سبيل المثال ، إذا تم طرد 200 مل من البكتيريا ، أضف 2 مل من المحلول الملحي العادي لتعليق الحبيبات.
10. قم بتأكيد البكتيريا CFU (يجب أن يكون حوالي 10⁹ CFU / 100 ميكرولتر بعد التكثيف في محلول ملحي عادي) عن طريق طلاء البكتيريا المركزة من خلال تخفيف تسلسلي 10 أضعاف.

النتائج

الشكل 1: الجدول الزمني لمخطط تدفق التحضير التجريبي.

نظرة عامة على التوقيت اللازم لتحضير بكتيريا EHEC المتوهجة بيولوجيا ومعالجة الفئران مسبقا بالستربتومايسين. (أ) التحضير للجنة التنسيق العالي الانتخابي. (ب) تحضير الفئران.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
حاضنة شاكر	ييه دير	إل إم -570 آر	حضانة البكتيريا
حاضنة اهتزاز مدارية	فيريستك	إس300	حضانة البكتيريا
الجلسرين	سيغما	جي 5516-1 لتر	استخدم لمحلول تخزين البكتيريا
كلوريد الصوديوم	سيغما	31434-5 كجم - آر	مادة كيميائية لصنع وسط LB ، 10 جم / لتر
التربتون	برونادىسا كوندا	القط 1612.00	مادة كيميائية لصنع وسط LB ، 10 جم / لتر
مسحوق مستخلص الخميرة	أفيمتريكس	23547-1 كجم	مادة كيميائية لصنع وسط LB ، 5 جم / لتر
اجار	برونادىسا كوندا	القط 1802.00	مادة كيميائية لصنع LB agar
كاناميسين	سيغما	K4000-5G	المضادات الحيوية ، تستخدم في Seleciiton
الستربتومايسين	سيغما	S6501-100G	المضادات الحيوية ، والقضاء على الجراثيم في الفئران
جهاز طرد مركزي عالي السرعة	بيكمان كولتر	أفانتي ، J-26S XP	استخدم لأجهزة الطرد المركزي للبكتيريا
دوار بزاوية ثابتة	بيكمان كولتر	JA25.5	استخدم لأجهزة الطرد المركزي للبكتيريا
دوار بزاوية ثابتة	بيكمان كولتر	جي إل إيه10.5	استخدم لأجهزة الطرد المركزي للبكتيريا
زجاجات الطرد المركزي	بيكمان كولتر	REF357003	استخدم لأجهزة الطرد المركزي للبكتيريا
زجاجات الطرد المركزي	ثيرمو فيشر العلمي	3141-0500	استخدم لأجهزة الطرد المركزي للبكتيريا
مقياس الضوئي الحيوي Eppendorf plus	إيبندورف	AG 22331 هامبورغ	لقياس قيمة OD600 للبكتيريا