عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من عينة ماء للتحليل الجزيئي

الملخص

المصدر: Ghadigaonkar، D. and Rath، A. عزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المنقولة بالماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو عزل وتحضير البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من عينة الماء باستخدام وسائط انتقائية. يتم استخراج الحمض النووي من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية وتضخيمه لتحديد الجينات المقاومة للمضادات الحيوية البكتيرية.

البروتوكول

1. جمع العينات ومعالجتها

1. جمع العينات
   1. اجمع الحجم المناسب لعينة الماء في حاويات عينات معقمة ، مع التأكد من عدم ملء أكثر من 3/4 من الحاوية.
   2. نقل العينات إلى المختبر في ظروف معقمة في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ومعالجتها على الفور.
2. تجهيز العينات
   1. قم بتصفية عينة الماء بشكل معقم من خلال قطعة قماش موسلين معقمة لإزالة أي جسيمات.
   2. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية المناسبة للمياه المفلترة لمزيد من التحليل.

2. تقدير الحمل البكتيري الكلي وعدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية

1. تحديد الحمل البكتيري الكلي
   1. 18.12 جم من مسحوق Reasoner's 2A agar (R2A agar) المعدل في 1,000 مل من الماء المقطر المزدوج وقم بإذابة الخليط عن طريق التسخين. قم بالأوتوكلاف للخليط المذاب عند 121 درجة مئوية ، 15 رطلا لكل بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد ألواح R2A Agar المعدلة عن طريق صب الكمية المناسبة من الخليط المعقم في ألواح بتري معقمة (على سبيل المثال ، أضف ما يقرب من 20 مل من الوسط المعقم المعقم إلى صفيحة بتري معقمة 90 مم).
   2. بمجرد أن يتجمد الوسط ، انشر بالتساوي 100 ميكرولتر من التخفيفات المناسبة لعينة الماء المفلترة على R2A Agar ، اللوحة المعدلة. قم بإجراء التجربة بشكل مكرر.
   3. احتضان جميع الألواح المذكورة أعلاه عند 35-37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (قم بتغيير درجة الحرارة ووقت الحضانة حسب الوسائط المستخدمة للعزل).
   4. عبر عن الحمل البكتيري الكلي بدلالة وحدات تكوين المستعمرة لكل مليلتر (CFU/mL) باستخدام المعادلة (1):
2. تحديد عدد بكتيريا AR
   1. اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.4. ومع ذلك ، بدلا من R2A Agar ، الألواح المعدلة ، استخدم R2A Agar ، والألواح المعدلة المكملة بشكل فردي بخمسة مضادات حيوية مختلفة ، وهي سيفوتاكسيم (3 ميكروغرام / مل) ، سيبروفلوكساسين (0.5 ميكروغرام / مل) ، إريثروميسين (20 ميكروغرام / مل) ، كانامايسين (15 ميكروغرام / مل) ، وفانكومايسين (3 ميكروغرام / مل).
   2. أضف المضادات الحيوية بشكل منفصل في أنابيب تحتوي على 20 مل من R2A Agar المصهور المعقم ، المعدل (مع درجة حرارة R2A Agar المصهور ، معدل عند ≤40 درجة مئوية) لتحقيق تركيز المضادات الحيوية النهائي كما هو مذكور في الخطوة 2.2.1.
   3. قم بالتدوير للخلط المتساوي واسكبه على ألواح بتري معقمة قبل أن يتجمد الأجار. قم بإجراء التجربة بشكل مكرر.
   4. احتضان جميع الألواح المذكورة أعلاه عند 35-37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (قد تختلف درجة الحرارة ووقت الحضانة إذا كنت تستخدم وسائط مختلفة).
   5. لمراقبة الجودة والتحقق من فعالية المضادات الحيوية ، انشر 100 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية من سلالات الإشريكية القولونية ATCC 25922 و Staphylococcus aureus ATCC 29213 على R2A Agar المحتوية على المضادات الحيوية ، والألواح المعدلة (تأكد من أن كثافة المزرعة الطازجة المستخدمة في التلقيح هي الكثافة البصرية ، OD = 0.5 عند 600 نانومتر).
   6. تحديد عدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من حيث CFU / مل كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.

3. تحديد البكتيريا القابلة للزراعة عن طريق تسلسل جينات الحمض النووي الريبي الريبوزومي (rRNA) 16S

1. تحضير قالب الحمض النووي من العزلات لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
   1. باستخدام عود أسنان معقم ، خذ مستعمرة واحدة معزولة ونقية من العزلة التي تنمو على طبق بتري. المستعمرة البكتيرية في 100 ميكرولتر من الماء المعقم المقطر المزدوج في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم واتركه يغلي لمدة 10 دقائق.
   2. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين لحبيبات الحطام ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد لاستخدامه كقالب الحمض النووي الخام.
2. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المستهدف لمنطقة V3 من جين 16S rRNA والتسلسل
   1. قم بإعداد 40 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو مذكور في الجدول 1.
      ملاحظه: يجب أن يتم تحضير الحمض النووي على كتلة ثلجية مع تقليل فرصة التلوث (ارتداء القفازات أثناء التعامل مع الكواشف ، وتنظيف سطح العمل جيدا باستخدام 70٪ إيثانول).
   2. ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية ، وقم بتشغيل البرنامج المناسب في جهاز التدوير الحراري PCR. انظر الجدول 2 للحصول على ظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الموحدة ومعلومات التمهيدي لتضخيم مناطق V3 لجينات 16S rRNA.

الجدول 1: مكونات ماسترميكس PCR. تكوين خليط التفاعل من كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة.

كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل	الحجم (ميكرولتر)
2x تاك ماستر ميكس	20
التمهيدي الأمامي (10 بيكو مول)	1.5
التمهيدي العكسي (10 بيكو مول)	1.5
قالب الحمض النووي الخام	1.5
مياه البيولوجيا الجزيئية المعقمة	15.5
الحجم الإجمالي	40

 

 

 

 

 

 

 

الجدول 2: ظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين 16S rRNA. يتم عرض شروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة لتضخيم جين 16S rRNA. تتضمن الخطوات خطوة تمسخ أولية ، تليها 35 دورة من التمسخ والتلدين والتمديد ، وخطوة تمديد نهائية.

اتجاه	تسلسل التمهيدي 5 '- 3'	شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل	لا. من الدورات
أمامي	GGAGGCAGCAGTAAGGAGAT	94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق	1
		تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية	35
		التلدين عند 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
		تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية
عكس	CTACCGGGGTATTATCC	التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق	1

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2x PCR Taq ماسترميكس	هاي ميديا	إم بي تي 061-50R	لصنع خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
حاضنة 37 درجة مئوية	GS-192 ، Gayatri Scientific	NA	لحضانة البكتيريا
الأوتوكلاف	اكويترون	NA	مطلوب لتعقيم الوسائط ، والألواح الزجاجية ، وأنابيب الاختبار ، وما إلى ذلك
خزانة Bisafety B2	IMSET	IMSET BSC - الفئة II من النوع B2	تستخدم للعمل الميكروبيولوجي مثل الزراعة البكتيرية ، AST ، إلخ.
مسحوق المضاد الحيوي سيفوتاكسيم	هاي ميديا	TC352-5G	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
جهاز الطرد المركزي minispin	إيبندورف	ميني سبين بلس -5453	تستخدم لتكوير الحطام أثناء تحضير الحمض النووي الخام
مسحوق المضادات الحيوية سيبروفلوكساسين	هاي ميديا	TC447-5G	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
مقياس الألوان	طلب	NA	للتحقق من OD لتعليق الثقافة
حاضنة شاكر التبريد	BTL41 الحلفاء العلمية	NA	لحضانة لوحات الوسائط لزراعة البكتيريا
مسحوق المضاد الحيوي الإريثروميسين	هاي ميديا	CMS528-1G	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
مسحوق المضاد الحيوي الإريثروميسين	هاي ميديا	TC024-5G	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
مسحوق المضاد الحيوي Kanamycin	هاي ميديا	MB105-5G	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
مرق لوريا بيرتاني	هيميديا	م 1245-500 جرام	لإثراء الثقافات
R2A Agar ، معدل	هاي ميديا	م 1743	لتحضير لوحات الوسائط لعزل الحمل البكتيري الكلي والمقاوم للمضادات الحيوية (AR)
كلوريد الصوديوم	هاي ميديا	TC046-500 جرام	لتحضير محلول ملحي 0.85٪ لتخفيف عينة الماء بشكل متسلسل
المكورات العنقودية الذهبية subsp. الذهبي ATCC 29213	هاي ميديا	0365 ف	تستخدم كعنصر تحكم أثناء إجراء AST
مسحوق المضاد الحيوي فانكومايسين	هاي ميديا	سم 217	لتحضير محلول مخزون المضادات الحيوية المطلوب أثناء عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية
ميزان الوزن	ميتلر توليدو	ME204 ميتلر توليدو	تستخدم لوزن مساحيق الوسائط ومساحيق الكاشف وما إلى ذلك.