عزل البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من عينة ماء للتحليل الجزيئي

الملخص

المصدر: Ghadigaonkar، D. and Rath، A. عزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المنقولة بالماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو عزل وتحضير البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من عينة الماء باستخدام وسائط انتقائية. يتم استخراج الحمض النووي من البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية وتضخيمه لتحديد الجينات المقاومة للمضادات الحيوية البكتيرية.

البروتوكول

1. جمع العينات ومعالجتها

1. جمع العينات
   1. اجمع الحجم المناسب لعينة الماء في حاويات عينات معقمة ، مع التأكد من عدم ملء أكثر من 3/4 من الحاوية.
   2. نقل العينات إلى المختبر في ظروف معقمة في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ومعالجتها على الفور.
2. تجهيز العينات
   1. قم بتصفية عينة الماء بشكل معقم من خلال قطعة قماش موسلين معقمة لإزالة أي جسيمات.
   2. قم بإجراء التخفيفات التسلسلية المناسبة للمياه المفلترة لمزيد من التحليل.

2. تقدير الحمل البكتيري الكلي وعدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية

1. تحديد الحمل البكتيري الكلي
   1. 18.12 جم من مسحوق Reasoner's 2A agar (R2A agar) المعدل في 1,000 مل من الماء المقطر المزدوج وقم بإذابة الخليط عن طريق التسخين. قم بالأوتوكلاف للخليط المذاب عند 121 درجة مئوية ، 15 رطلا لكل بوصة مربعة (رطل لكل بوصة مربعة) لمدة 20 دقيقة. قم بإعداد ألواح R2A Agar المعدلة عن طريق صب الكمية المناسبة من الخليط المعقم في ألواح بتري معقمة (على سبيل المثال ، أضف ما يقرب من 20 مل من الوسط المعقم المعقم إلى صفيحة بتري معقمة 90 مم).
   2. بمجرد أن يتجمد الوسط ، انشر بالتساوي 100 ميكرولتر من التخفيفات المناسبة لعينة الماء المفلترة على R2A Agar ، اللوحة المعدلة. قم بإجراء التجربة بشكل مكرر.
   3. احتضان جميع الألواح المذكورة أعلاه عند 35-37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (قم بتغيير درجة الحرارة ووقت الحضانة حسب الوسائط المستخدمة للعزل).
   4. عبر عن الحمل البكتيري الكلي بدلالة وحدات تكوين المستعمرة لكل مليلتر (CFU/mL) باستخدام المعادلة (1):
2. تحديد عدد بكتيريا AR
   1. اتبع الخطوات 2.1.1-2.1.4. ومع ذلك ، بدلا من R2A Agar ، الألواح المعدلة ، استخدم R2A Agar ، والألواح المعدلة المكملة بشكل فردي بخمسة مضادات حيوية مختلفة ، وهي سيفوتاكسيم (3 ميكروغرام / مل) ، سيبروفلوكساسين (0.5 ميكروغرام / مل) ، إريثروميسين (20 ميكروغرام / مل) ، كانامايسين (15 ميكروغرام / مل) ، وفانكومايسين (3 ميكروغرام / مل).
   2. أضف المضادات الحيوية بشكل منفصل في أنابيب تحتوي على 20 مل من R2A Agar المصهور المعقم ، المعدل (مع درجة حرارة R2A Agar المصهور ، معدل عند ≤40 درجة مئوية) لتحقيق تركيز المضادات الحيوية النهائي كما هو مذكور في الخطوة 2.2.1.
   3. قم بالتدوير للخلط المتساوي واسكبه على ألواح بتري معقمة قبل أن يتجمد الأجار. قم بإجراء التجربة بشكل مكرر.
   4. احتضان جميع الألواح المذكورة أعلاه عند 35-37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة (قد تختلف درجة الحرارة ووقت الحضانة إذا كنت تستخدم وسائط مختلفة).
   5. لمراقبة الجودة والتحقق من فعالية المضادات الحيوية ، انشر 100 ميكرولتر من المعلقات البكتيرية من سلالات الإشريكية القولونية ATCC 25922 و Staphylococcus aureus ATCC 29213 على R2A Agar المحتوية على المضادات الحيوية ، والألواح المعدلة (تأكد من أن كثافة المزرعة الطازجة المستخدمة في التلقيح هي الكثافة البصرية ، OD = 0.5 عند 600 نانومتر).
   6. تحديد عدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من حيث CFU / مل كما هو موضح في الخطوة 2.1.4.

3. تحديد البكتيريا القابلة للزراعة عن طريق تسلسل جينات الحمض النووي الريبي الريبوزومي (rRNA) 16S

1. تحضير قالب الحمض النووي من العزلات لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
   1. باستخدام عود أسنان معقم ، خذ مستعمرة واحدة معزولة ونقية من العزلة التي تنمو على طبق بتري. المستعمرة البكتيرية في 100 ميكرولتر من الماء المعقم المقطر المزدوج في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم واتركه يغلي لمدة 10 دقائق.
   2. قم بالطرد المركزي للتعليق عند 10,000 × جم لمدة دقيقتين لحبيبات الحطام ، ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم جديد لاستخدامه كقالب الحمض النووي الخام.
2. تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المستهدف لمنطقة V3 من جين 16S rRNA والتسلسل
   1. قم بإعداد 40 ميكرولتر من خليط التفاعل في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو مذكور في الجدول 1.
      ملاحظه: يجب أن يتم تحضير الحمض النووي على كتلة ثلجية مع تقليل فرصة التلوث (ارتداء القفازات أثناء التعامل مع الكواشف ، وتنظيف سطح العمل جيدا باستخدام 70٪ إيثانول).
   2. ضع الأنبوب في الكتلة الحرارية ، وقم بتشغيل البرنامج المناسب في جهاز التدوير الحراري PCR. انظر الجدول 2 للحصول على ظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الموحدة ومعلومات التمهيدي لتضخيم مناطق V3 لجينات 16S rRNA.

الجدول 1: مكونات ماسترميكس PCR. تكوين خليط التفاعل من كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل المختلفة.

كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل	الحجم (ميكرولتر)
2x تاك ماستر ميكس	20
التمهيدي الأمامي (10 بيكو مول)	1.5
التمهيدي العكسي (10 بيكو مول)	1.5
قالب الحمض النووي الخام	1.5
مياه البيولوجيا الجزيئية المعقمة	15.5
الحجم الإجمالي	40

 

 

 

 

 

 

 

الجدول 2: ظروف دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جين 16S rRNA. يتم عرض شروط دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوبة لتضخيم جين 16S rRNA. تتضمن الخطوات خطوة تمسخ أولية ، تليها 35 دورة من التمسخ والتلدين والتمديد ، وخطوة تمديد نهائية.

اتجاه	تسلسل التمهيدي 5 '- 3'	شروط تفاعل البوليميراز المتسلسل	لا. من الدورات
أمامي	GGAGGCAGCAGTAAGGAGAT	94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق	1
		تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية	35
		التلدين عند 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
		تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 40 ثانية
عكس	CTACCGGGGTATTATCC	التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق	1

المواد