نظام زراعة مشتركة لدراسة الاستجابات الجزيئية لمضيفات النبات والبكتيريا المتفاعلة

الملخص

المصدر: Nathoo, N., et al. نظام زراعة مائية مشتركة للتحليل المتزامن والمنهجي للتفاعلات الجزيئية بين النبات والميكروب والإشارات. J. Vis. خبرة. (2017).

يوضح هذا الفيديو نظام الزراعة المشتركة المائية لدراسة تفاعلات النبات والبكتيريا في ظل ظروف معقمة. يتم نقل شتلات النباتات إلى وسط نمو معقم وحمضي ، وتحضينها ، وفحصها بحثا عن التلوث قبل التلقيح ب Agrobacterium. البكتيريا المنشطة تعلق على جذور النباتات, نقل T-DNA إلى الخلايا النباتية, وتعزيز التغيرات الجزيئية التي تعزز الاستعمار البكتيري.

البروتوكول

1. نظام الزراعة المشتركة المائية

1. تحضير وسط Murashige و Skoog (MS) السائل: 2.165 جم / لتر من الأملاح القاعدية MS ، 10 جم / لتر من السكروز ، 0.25 جم / لتر 2- (N-morpholino) حمض إيثانيسلفونيك (MES) ، و 59 مل / لتر مزيج فيتامين B5 ، درجة الحموضة 5.75.
2. الأوتوكلاف الوسط. صب 18 مل منه في كل زجاج أسطواني معقم أو خزان بلاستيكي شفاف (أطباق متبلورة ، 100 × 80 مم 2) بأغطية معقمة.
   ملاحظه: قم بتعقيم الخزانات والأغطية عن طريق لفها بورق الألمنيوم والتعقيم.
3. في غطاء التدفق المعقم ، استخدم ملقطا معقما لنقل كل مربع شبكي برفق مع شتلات عمرها 10-14 يوما من الوسط شبه الصلب إلى خزان أسطواني مائي (الشكل 1 د). أغلق الأغطية على الخزانات باستخدام شريط جراحي مسامي.
4. ازرع الشتلات على الشبكة في الخزان لمدة 72 ساعة عند 22-24 درجة مئوية ، مع فترة ضوئية 16 ساعة واهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة للتهوية (الشكل 1 ه).
   ملاحظه: هذا يسمح للنباتات بالتكيف مع البيئة المائية قبل التلقيح (الزراعة المشتركة) بالكائنات الحية الدقيقة. ستسمح فترة الانتظار هذه أيضا بظهور التلوث الميكروبي العرضي قبل التلقيح.
   1. ابدأ الخطوة التالية في اليوم السابق لنهاية فترة الحضانة.
5. ازرع Agrobacterium tumefaciens في وسط agrobacterium (AB) (0.5٪ وزن / حجم مستخلص الخميرة ، 0.5٪ وزن / حجم تريبتون ، 0.5٪ وزن / حجم السكروز ، 50 ملي مولار MgSO₄ ، درجة الحموضة 7.0) عند 28 درجة مئوية مع الاهتزاز طوال الليل حتى تصل المزرعة إلى كثافة بصرية نهائية تبلغ 1.0 عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) ، كما تم قياسها باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، مع وسط AB غير الملقح كفارغ.
   ملاحظه: OD₆₀₀ من 1.0 يعادل حوالي 10⁹ خلايا / مل.
6. اغسل A. tumefaciens ثلاث مرات بحجم متساو من 0.85٪ كلوريد الصوديوم. أعد التعليق في حجم متساو من الماء المعقم المقطر المزدوج.
7. قبل التلقيح ، افحص الخزان بالشتلات بعناية للتأكد من عدم وجود تلوث ؛ يجب أن يكون الوسيط الموجود في الخزانات غير الملوثة واضحا وشفافا.
   1. تخلص من أي خزان به سائل غائم (تلوث) وقم بترقيم باقي الخزانات. قم بتذوق كمية صغيرة (20 ميكرولتر) من الوسط المائي من كل خزان مرقم وقم بوضعه على طبق بتري مليء بمرق لوريا (LB). احتضن الطبق عند 28 درجة مئوية.
8. على الفور ، أضف 50 ميكرولتر من معلق A. tumefaciens (حوالي 5 × 10⁷ خلايا ، مقدرة من OD₆₀₀) في كل خزان مائي مرقم. شارك في زراعة شتلات نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا و A. tumefaciens عند 22-24 درجة مئوية مع فترة ضوئية 16 ساعة واهتزاز عند 50 دورة في الدقيقة (الشكل 3f).
   1. افحص لوحة LB المرقطة من الخطوة 1.7.1. بعد 12 و 28 ساعة من الحضانة للتحقق من عقم الخزانات. إذا كان هناك أي تلوث ، فلا تستخدم الخزان المرقم المقابل (الملقح بالبكتيريا) لمزيد من المقايسات النهائية.
9. إذا رغبت في ذلك ، راقب نمو A. tumefaciens على فترات منتظمة عن طريق إزالة عينة من الوسط من الخزان وقياس OD₆₀₀ باستخدام مقياس الطيف الضوئي مع وسيط من عنصر تحكم غير ملقح كفارغ (الشكل 2).
   ملاحظه: يجب أن تظهر أعراض أمراض النبات بعد 7 أيام (الشكل 3).

النتائج

الشكل 1: نظام الزراعة المشتركة للنباتات والميكروبات المائية. تمثل اللوحة اليسرى مخططا انسيابيا يحدد الخطوات الرئيسية الست في تجميع وتشغيل نظام الزراعة المشتركة المائية. توضح اللوحة اليمنى المواد والمعدات والإجراءات التشغيلية التجريبية الفعلية ل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
بذور النباتات (نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا كول-0)	مركز الموارد البيولوجية نبات الأرابيدوبسيس	عال7000	https://abrc.osu.edu/order-stocks
البكتيريا (Agrobacterium tumefaciens C58)	جامعة واشنطن	غير متاح
البكتيريا المسماة	داخلي		اختياري ، يعتمد على تحليلات المصب
ماء مقطر مزدوج	(مختلف)
ماصة دقيقة	(مختلف)
أملاح موراشيج وسكوج (MS) القاعدية	سيجما ألدريتش	م 5524
سكروز	(مختلف)
مس	(مختلف)
مزيج فيتامين ب 5	سيجما ألدريتش	جي 1019
فيتواجار	(مختلف)
أطباق بتري العميقة	(مختلف)
شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ	شركة فيرير سلك للسلع المحدودة	غير متاح	درجة: 304 ؛ عدد الشبكات: 40 × 40 ؛ سلك ضياء: 0.01
شريط Micropore ، 1 بوصة	3 م	1530-1
غرفة النمو النهاري	(مختلف)
خزانات زجاجية أسطوانية ، 100 × 80 مم	بيركس	3250	يمكن استخدام أحجام أخرى ، وفي هذه الحالة قد يحتاج المحتوى السائل إلى تعديل
غطاء المحرك	(مختلف)
ملقط	(مختلف)
مستخلص الخميرة	(مختلف)
التربتون	(مختلف)
MgSO₄	(مختلف)
حاضنة اهتزاز	(مختلف)