تحضير بكتريا قولونية الكروية

الملخص

المصدر: فيغيروا ، دي إم ، et.al. إنتاج وتصور البلاستيدات الكروية البكتيرية والبروتوبلاستات لتوصيف توطين الببتيدات المضادة للميكروبات. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو إنتاج البلاستيدات الكروية الإشريكية القولونية عن طريق تثبيط انقسام الخلايا أولا للحث على الفتيل ، متبوعا بالهضم الأنزيمي لجدار الخلية. تتضمن العملية إضافة خاضعة للرقابة لعامل مخلب ، DNase ، ومثبت تناضحي لضمان تكوين البلاستيدات الكروية المناسبة واستقرارها للمراقبة المجهرية.

البروتوكول

1. تحضير المحلول

1. قم بإعداد 1 M Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.8 عن طريق إذابة 10.34 جم من Tris HCl و 4.17 جم من Tris OH في 50 مل من dH₂O في قارورة 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
2. قم بإعداد المحلول A (20 ملي مولار MgCl₂ ، 0.7 M سكروز ، 10 ملي مولار Tris-Cl ، الرقم الهيدروجيني 7.8) عن طريق إذابة 0.10 جم MgCl₂ (95.2 جم / مول) و 11.98 جم من السكروز (342.3 جم / مول) في 25 مل dH₂O في قارورة سعة 125 مل. أضف 500 ميكرولتر 1 M Tris-Cl (الرقم الهيدروجيني 7.8) واضبط الحجم على 50 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
3. تحضير المحلول B (10 ملي مولار MgCl₂ ، 0.8 M سكروز ، 10 ملي مولار Tris-Cl ، درجة الحموضة 7.8) عن طريق إذابة 0.05 جم MgCl₂ (95.2 جم / مول) و 13.69 جم من السكروز (342.3 جم / مول) في 25 مل dH₂O في قارورة سعة 125 مل. أضف 500 ميكرولتر 1 M Tris-Cl (الرقم الهيدروجيني 7.8) واضبط الحجم على 50 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بإعداد 0.8 مليون سكروز عن طريق إذابة 13.69 جم من السكروز (342.3 جم / مول) في 50 مل dH₂O في قارورة سعة 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بإعداد 5 مجم / مل من نوكلياز الديوكسي ريبونوكلياز I (DNase I) عن طريق إذابة 0.015 جم من DNase I في 3 مل من dH₂O في قارورة 50 مل. التعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر. محلول Aliquot في أنابيب microfuge وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
6. قم بإعداد 0.125 M من حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) ، الرقم الهيدروجيني 8.0 عن طريق إذابة 0.698 جم من مجففات ثنائي الصوديوم EDTA (372.2 جم / مول) إلى 15 مل dH₂O في قارورة سعة 125 مل. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
7. قم بإعداد 600 ميكروغرام / مل من السيفاليكسين عن طريق إذابة 0.03 جم من هيدرات السيفاليكسين (365.404 جم / مول) في 50 مل من dH₂O في قارورة سعة 125 مل. تعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي عند 4 درجات مئوية.
8. تحضير 5 مجم / مل من الليزوزيم عن طريق إذابة 0.015 جم من الليزوزيم في 3 مل من dH₂O في قارورة 50 مل. التعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر. محلول Aliquot في أنابيب microfuge وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
9. قم بإعداد 3٪ مع مرق الصويا من التربتيكاز (TSB) عن طريق إذابة 30 جم من TSB في 1 لتر من dH₂O في قارورة سعة 2 لتر. قم بتقسيم المحلول إلى قوارير تحتوي على 25 مل أو 100 مل TSB لاستخدامها في تحضير الإشريكية القولونية الكروي. قوارير الأوتوكلاف لتعقيم الوسط السائل. يمكن تخزين TSB المعقم إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.

2. تحضير الثقافة بين عشية وضحاها

ملاحظه: قم بإجراء الأقسام 2-3 باستخدام تقنيات معقمة مناسبة. إذا رغبت في ذلك ، يمكن أن تحتوي السلالة البكتيرية على بلازميد لمقاومة المضادات الحيوية لتقليل التلوث المحتمل. في حالة استخدام سلالة مقاومة للمضادات الحيوية ، أضف المضادات الحيوية اللازمة في الخطوتين 2.1 و 3.1-3.2.

1. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق قطف مستعمرة واحدة من البكتيريا باستخدام طرف ماصة معقمة ووضعها في أنبوب مزرعة سعة 14 مل يحتوي على 2-3 مل من 3٪ وزنا / حجم TSB. احتضان عند 37 درجة مئوية ، مع رجها لمدة 16-21 ساعة.

3. تحضير البلاستيدات الكروية الإشريكية القولونية سالبة الجرام

1. في قارورة سعة 250 مل ، قم بتخفيف المزرعة الليلية 1: 100 في حجم 25 مل من 3٪ وزن / حجم TSB واحتضان المحلول البكتيري عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز لمدة 2.5 ساعة تقريبا حتى يصل المحلول إلى كثافة بصرية تتراوح من 0.5 إلى 0.8 عند 600 نانومتر. قم بقياس الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
2. في قارورة سعة 250 مل ، قم بتخفيف هذه المزرعة 1:10 في 30 مل من 3٪ وزن / حجم TSB واحتضان عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز لمدة 2.5 ساعة في وجود 60 ميكروغرام / مل سيفاليكسين (347.4 جم / مول) لإنتاج خيوط خلية واحدة يبلغ طولها حوالي 50-150 ميكرومتر ، والتي يمكن ملاحظتها تحت تكبير 1,000X باستخدام مجهر ضوئي (الشكل 1 ب).
3. احصد الخيوط عن طريق طرد المحلول البكتيري عند 1,500 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق. صب وتخلص من المادة الطافية ، واحتفظ بالحبيبات.
4. اغسل الخيوط بإضافة 1 مل من السكروز 0.8 M برفق ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. احتضان لمدة 1 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
5. أضف 150 ميكرولتر من 1 M Tris-Cl (درجة الحموضة 7.8) ، و 120 ميكرولتر من 5 مجم / مل من الليزوزيم ، و 30 ميكرولتر من 5 مجم / مل DNase I ، و 120 ميكرولتر من 0.125 M EDTA بالترتيب الخاص بها إلى الحبيبات واحتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
6. أضف 1 مل من المحلول A تدريجيا على مدار دقيقة واحدة إلى المحلول المحضر في 3.5 باستخدام ماصة دقيقة مع تحريك المحلول برفق يدويا. احتضان المحلول لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. ضع 7 مل من محلول 4 درجة مئوية B في أنبوبين مخروطيين سعة 15 مل. أضف كميات متساوية من المحلول المحضر في 3.6 لكل من هذين الأنبوبين. جهاز طرد مركزي للمحلول عند 1,500 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 4 دقائق.
8. باستخدام ماصة مصلية ، قم بإزالة جميع المواد الطافية بعناية باستثناء 1-2 مل دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة P1000 دقيقة. تحقق بصريا لرؤية تكوين البلاستيدات الكروية من خلال مراقبة العينة عند تكبير 1,000X باستخدام مجهر ضوئي (الشكل 1 ج).
9. قم بتخزين البلاستيدات الكروية في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع أو حتى تمر ب 3 دورات تجميد وإذابة.

النتائج

الشكل 1: صور تمثيلية للإشريكية القولونية. (أ) بكتيريا الإشريكية القولونية (ب) الإشريكية القولونية ثعبان و (ج) بكتريا قولونية كروية. ...

المواد