توليد البروتوبلاستات من البكتيريا موجبة الجرام Bacillus megaterium

الملخص

المصدر: فيغيروا ، دي إم ، وآخرون. إنتاج وتصور البلاستيدات الكروية البكتيرية والبروتوبلاستات لتوصيف توطين الببتيدات المضادة للميكروبات. J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو إجراء خطوة بخطوة لتوليد البروتوبلاستات من البكتيريا موجبة الجرام Bacillus megaterium.

البروتوكول

1. تحضير المحلول

1. تحضير 5 مجم / مل من الليزوزيم عن طريق إذابة 0.015 جم من الليزوزيم في 3 مل من dH₂O في قارورة 50 مل. التعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر. محلول Aliquot في أنابيب microfuge وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
2. قم بإعداد 3٪ مع مرق الصويا من التربتيكاز (TSB) عن طريق إذابة 30 جم من TSB في 1 لتر من dH₂O في قارورة سعة 2 لتر. Aliquot المحلول في قوارير تحتوي على 100 مل TSB لاستخدامها في تحضير B. megaterium protoplasts. قوارير الأوتوكلاف لتعقيم الوسط السائل. يمكن تخزين TSB المعقم إما في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية.
3. قم بإعداد المحلول C (1 M سكروز ، 0.04 M ماليات ، 0.04 M MgCl₂ ، الرقم الهيدروجيني 6.5) عن طريق إذابة 34.23 جم من السكروز (342.3 جم / مول) ، 0.46 جم حمض الماليك (116.07 جم / مول) ، و 0.38 جم MgCl₂ (95.21 جم / مول) في 100 مل من dH₂O في قارورة 250 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5. قم بالتعقيم عن طريق الترشيح من خلال مرشح حقنة 25 مم بغشاء 0.2 ميكرومتر وتخزينه في أنبوب مخروطي في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بإعداد 200 مل من وسط البروتوبلاست عن طريق خلط 100 مل 3٪ وزن / حجم TSB و 100 مل من محلول C في زجاجة زجاجية سعة 1 لتر. الأوتوكلاف لتعقيم المحلول وتخزينه في درجة حرارة الغرفة.

2. تحضير بروتوبلاست موجبة الجرام B. megaterium

1. في قارورة سعة 250 مل ، قم بتخفيف المزرعة الليلية 1: 1,000 في 100 مل من 3٪ وزن / حجم TSB واحتضان المحلول البكتيري عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز لمدة 4.5 ساعة تقريبا حتى يصل المحلول إلى كثافة بصرية تتراوح من 0.9-1.0 عند 600 نانومتر. قم بقياس الكثافة الضوئية باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
2. صب المزرعة السائلة في أنبوبين مخروطيين سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
3. باستخدام ماصة مصلية ، تخلص من المادة الطافية من كلا الأنبوبين المخروطيين. أعد تعليق كل حبيبات في وسط بروتوبلاست سعة 2.5 مل واجمع المحاليل المعلقة في أنبوب مخروطي واحد. ماصة المحلول المعلق المركب في قارورة سعة 125 مل.
4. أضف 1 مل من 5 مجم / مل ليزوزيم واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، أثناء الرج.
5. راقب نمو البروتوبلاستات تحت تكبير 1,000x باستخدام مجهر ضوئي ، مع ملاحظة أي مخالفات ، مثل البكتيريا التي تظهر على شكل قضبان منتفخة بدلا من الكرات (الشكل 1). باستخدام ماصة مصلية ، انقل المحلول إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 2,000 × جم ، 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
6. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في وسائط بروتوبلاست 5 مل. قم بتخزين البروتوبلاست في درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع أو حتى تمر ب 3 دورات تجميد وإذابة.

النتائج

الشكل 1: صور تمثيلية ل B. megaterium. (أ) بكتيريا B. megaterium و (B) B. megaterium protoplast. تم التقاط الصور بتكبير 100X

المواد