تقييم ترانسيتوس الخلايا للإشريكية القولونية عبر الطبقات الأحادية الظهارية المعوية

الملخص

المصدر: إسلام ، أ. ، وآخرون ، تقييم ترانجيستوز الخلايا المعوية لعزلات الإشريكية القولونية لحديثي الولادة. J. Vis. خبرة. (2023)

يوضح هذا الفيديو إجراء تقييم ترانجيستوز الخلايا للإشريكية القولونية لحديثي الولادة عبر الطبقات الظهارية الأحادية المعوية باستخدام إدخالات البئر ، وقياس المقاومة الكهربائية ، والقياس الكمي البكتيري.

البروتوكول

1. تلقيح الخلايا (بداية التجربة)

1. بعد ساعتين بالضبط ، قم بإزالة الثقافات البكتيرية الصباحية من الخلاط وقم بالطرد المركزي لمدة 10 دقائق (1,900 × جم ، 4 درجات مئوية).
   ملاحظه: لجميع الخطوات التالية ، احتفظ بجميع المعلقات البكتيرية على الثلج لتقليل النمو.
2. أعد تعليق حبيبات البكتيريا في وسط زراعة الأنسجة (TCM) بدون مضادات حيوية. استخدم مقياس الطيف الضوئي لضبط الكثافة البصرية (OD) إلى 0.7-0.9 ، وقم بتخفيفه باستخدام الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية بتركيز 1 × 10⁶ وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) / مل (تخفيف 1: 100 تقريبا). استخدم هذا المعلق البكتيري لإصابة كل ملحق ب 1 × 10⁵ CFU لكل حجم 100 ميكرولتر.
3. قم بتسمية لوحة transwell وإصابة كل ملحق ب 100 ميكرولتر من اللقاح المعدل بواسطة OD (إجمالي 1 × 10⁵ CFU لكل إدخال). بدأ الفحص الآن. لاحظ الوقت وقم بتسجيله ك t = 0 ساعة.
4. قم بطلاء المعلق البكتيري للتلقيح لتحديد كمية CFU / mL باستخدام طريقة تخفيف المسار ، وطلاء 10 ميكرولتر من الاقتباس على ألواح أجار LB مربعة.

2. القياس الكمي لعبور الخلايا

1. كل 30 دقيقة بعد التلقيح ، املأ الآبار الجديدة ب 500 ميكرولتر من الطب الصيني التقليدي بدون مضادات حيوية. انقل الإدخالات إلى هذه الآبار الجديدة باستخدام مجموعة مختلفة من الملقط المعقم لكل سلالة بكتيرية مختلفة.
2. اجمع الوسائط من بئر التجميع المستخدم لكل إدخال في أنابيب منفصلة تحمل العلامات. ضع هذه الأنابيب على الجليد. بين النقاط الزمنية ، أعد لوحات الترانسويل إلى الحاضنة.
3. لكل إدراج ، اجمع الوسائط التي تم جمعها من t = 0.5 h ، t = 1 h ، t = 1.5 h ، و t = 2 h ، والدوامة لفترة وجيزة. قم بصفيحة الوسائط التي تم جمعها على ألواح أجار Luria-Bertani (LB) باستخدام طريقة تخفيف المسار لتحديد كمية البكتيريا التي تم نقلها في أول ساعتين من التجربة.
   ملاحظه: إن استرداد البكتيريا كل 30 دقيقة وإبقائها على الجليد يقلل من نمو البكتيريا في آبار التجميع ، ويتم إجراء القياسات على بكتيريا العبور في الغالب.
4. ضع ألواح أجار LB التخفيف ذات المسار المسمى في الحاضنة البكتيرية عند 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون₂ الإضافي ، وأعد لوحة الترانسويل T84 إلى حاضنة زراعة الأنسجة.
5. عند t = 4 ساعات ، كرر الخطوة 2.3 عن طريق الجمع بين الوسائط التي تم جمعها من t = 2.5 ساعة ، و t = 3 ساعات ، و t = 3.5 ساعة ، و t = 4 ساعات.
6. عند t = 6 ساعات ، كرر الخطوة 2.3 عن طريق الجمع بين الوسائط التي تم جمعها من t = 4.5 ساعة ، و t = 5 ساعات ، و t = 5.5 h ، و t = 6 ساعات. بالإضافة إلى ذلك ، عند t = 6 ساعات ، قم بلوحة الوسائط من آبار التحكم.

3. نهاية التجربة

1. قم بقياس وتسجيل المقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEER) في نهاية التجربة ، t = 6 ساعات.
2. قم بتطهير المسبار عن طريق غمره في 70٪ إيثانول لمدة 10-15 دقيقة. إذا رغبت في ذلك ، تخلص من الإدخالات أو احفظها / معالجتها لتطبيقات إضافية. اسمح لألواح LB agar بالحضان طوال الليل ، وقم بتطهير و / أو التخلص من جميع المواد المستخدمة الأخرى بأمان.
3. بعد الحضانة طوال الليل ، قم بحساب المستعمرات البكتيرية يدويا على ألواح LB المخففة لتحديد كمية اللقاح وكمية الإشريكية القولونية عبر الخلوات. تأكد من أن لوحات التحكم لا تظهر أي نمو بكتيريا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
15 مل أنابيب مخروطية معقمة	العلوم المتوسطة	ج15 ب
أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل	افانت	AVSS2000
50 مل أنابيب مخروطية معقمة من مادة البولي بروبلين	صقر	352070
الطرد المركزي	سورفال	أسطورة RT
حلقات التلقيح التي تستخدم لمرة واحدة	فيشربراند	22363605
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)	جيبكو	11965-084
الظهارة فولت / أوم متر	الأدوات الدقيقة العالمية	إيدوم
شاكر الحاضنة	نيو برونزويك	إنوفا 4080
حاضنات	ثيرمو ساينتفيك	51030284	يتم استخدام ثلاثة من هذه في الطريقة: واحد لزراعة الأنسجة المعقمة ، وواحد لزراعة الأنسجة المصابة ، والآخر للحضانة البكتيرية.
مرق ليسوجيني	ديفكو	244610
أجار مرق ليسوجيني	IBI العلمي	IB49101
مقياس الطيف الضوئي	يونيكو	1100 ريال
T84 خلايا الأمعاء	مجموعة زراعة الأنسجة الأمريكية	CCL248
إدراج زراعة الأنسجة ، مع غشاء البولي إيثيلين تريفثاليت ، مسام 3 ميكرومتر ، تنسيق 24 بئر	صقر	353096
صفيحة زراعة الأنسجة ، 24 بئرا	صقر	353504