يوضح هذا الفيديو تحضير مزرعة بوريليا بورجدورفيري المعدلة وراثيا المصممة باستخدام الحمض النووي للعاثيات الخاملة التي تحمل جينا مقاوما للمضادات الحيوية. بعد اختيار المضادات الحيوية وحضانها ، يؤدي المحفز الكيميائي إلى تلف الحمض النووي ، مما يؤدي إلى استئصال وتكرار وتجميع فيريونات جديدة تحتوي على جين المقاومة. بعد الطرد المركزي الثاني وإعادة التعليق ، تكون الخلايا البكتيرية التي تحتوي على جزيئات فيروسية ناضجة جاهزة للتطبيقات النهائية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحضير وتحريض مزارع Borrelia burgdorferi لإنتاج الجسيمات الفيروسية
764 مشاهدة
⸱
سبتمبر 26, 2025
في هذه المقالة
الملخص
البروتوكول
1. تحضير ثقافة B. burgdorferi لإنتاج φBB-1
- تحضير وسط Barbour-Stoenner-Kelly المكمل ب 6.6٪ مصل أرنب عادي معطل حراريا (BSK). للحصول على 1 لتر من 1x BSK ، اجمع المكونات المدرجة في الجدول 1 في 900 مل من الماء ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.6 باستخدام 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم ، واخلطها ببطء عند 4 درجات مئوية لمدة 2-4 ساعات. بعد اكتمال الخلط ، تحقق من درجة الحموضة وأعد ضبطها إلى 7.6 إذا لزم الأمر ، وقم بزيادة الحجم إلى 1 لتر بالماء. قم بتعقيم الوسط عن طريق المرور عبر مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) واستخدمه طازجا أو تخزينه عند 4 درجات مئوية لمدة ≤2 شهر.
- قبل ثلاثة إلى خمسة أيام من بدء بروتوكول النقل ، قم بتلقيح 150 ميكرولتر من استنساخ (استنساخ) B. burgdorferi المناسب في 15 مل من 1x BSK في أنابيب طرد مركزي مخروطية معقمة مغطاة بإحكام (انظر جدول المواد). استكمل الوسط بالتركيز المناسب للمضادات الحيوية أو مزيج من المضادات الحيوية لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس داخل استنساخ (استنساخ) B. burgdorferi (الجدول 2).
ملاحظة: B. burgdorferi هو كائن حي من مستوى السلامة الحيوية 2. اتخذ جميع الاحتياطات المناسبة أثناء العمل مع هذا الكائن الحي. قم بإجراء جميع الأعمال باستخدام المزارع الحية ل B. burgdorferi في خزانة سلامة حيوية معتمدة ومعقمة بشكل صحيح من الدرجة الثانية. تخلص بشكل صحيح من جميع المواد التي تلامس B. burgdorferi والكائنات الحية نفسها بناء على إرشادات مراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها (CDC). - احتضن الثقافات عند 33 درجة مئوية دون اهتزاز حتى تصل الثقافات إلى كثافة ≥5 ×10 7 لولبيات مل−1 ، والتي تستغرق حوالي 3-5 أيام.
3. تحريض B. burgdorferi عاثية φBB-1
ملاحظة: تعقيم جميع الأواني الزجاجية والبلاستيكية عن طريق التعقيم ؛ قم بتعقيم جميع المحاليل عن طريق التعقيم أو الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. يتم عرض الخطوات أدناه بناء على أحجام 15 مل ، ولكن الطريقة قابلة للتطوير إلى أحجام أصغر أو أكبر اعتمادا على الاحتياجات الفردية للتجربة.
- بالنسبة لثقافة B. burgdorferi التي سيتم إنتاج العاثية منها (المتبرع) ، استخدم التركيز المحسوب بأي من الطريقتين في الخطوة 2 لتحديد حجم الثقافة البادئة اللازمة لإنتاج 4 مل من 2 × 108 لولبيات · مل −1. سيؤدي ذلك إلى تركيز نهائي من 5 × 107 لولبيات · مل −1 في 15 مل خلال مرحلة التعافي (الخطوة 3.6 أدناه).
- جهاز طرد مركزي حجم المزرعة المحسوبة في الخطوة 3.1 عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق. صب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 4 مل من BSK الطازج. انقل العينة إلى أصغر أنبوب معقم متاح لحمل العينة بأقل مساحة للرأس.
- أضف الكمية المناسبة من العامل المحفز إلى التركيز الموصى به (الجدول 3) بناء على حجم مزرعة 4 مل للحث على إنتاج العاثيات. قم بتغطية الأنبوب بإحكام واخلطه جيدا.
- احتضان العينة عند 33 درجة مئوية لمدة 2-4 ساعات.
- بعد الحضانة ، انقل العينة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للعينة عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق. صب الطافية.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 15 مل من 1x BSK.
الجدول 1: BSK لزراعة واختيار B. burgdorferi استنساخ لفحوصات التنبيغ. تعتمد صياغة وتحضير 1x BSK لزراعة B. burgdorferi و 1.5x BSK لاختيار الطور الصلب لاستنساخ B. burgdorferi الموصوفة هنا على Samuels. تركيبات مختلفة من BSK (أو MKP) التي تدعم نمو B. بورجدورفيري لم يتم اختبارها بعد باستخدام مقايسة التنقيح.
| مكون | 1x BSK (للاستزراع) (1 لتر) | 1.5x BSK (للطلاء) (1 لتر) |
| ألبومين مصل البقر (الكسر الخامس) | 35 جرام | 52.5 جرام |
| 10x CMRL-1066 (بدون L-glutamine) | 8 جرام | 12 جرام |
| Neopepton | 4 جرام | 6 جرام |
| خميرة | 1.6 جرام | 2.4 جرام |
| HEPES | 4.8 جرام | 7.2 جرام |
| الجلوكوز | 4 جرام | 6 جرام |
| سترات الصوديوم | 0.56 جرام | 0.84 جرام |
| بيروفات الصوديوم | 0.64 جرام | 0.96 جرام |
| ن-أسيتيل جلوكوزامين | 0.32 جرام | 0.48 جرام |
| بيكربونات الصوديوم | 1.76 جرام | 2.64 جرام |
| مصل الأرانب العادي المعطل بالحرارة (INRS) | 66 مل | 99 مل |
الجدول 2: المضادات الحيوية والتركيزات المحتملة التي سيتم استخدامها لاختيار وصيانة الحمض النووي غير المتجانس في B. burgdorferi. تستند هذه القائمة إلى العلامات الحالية المقاومة للمضادات الحيوية شائعة الاستخدام في Borrelia burgdorferi. يتم تحضير الكاناميسين والجنتاميسين والستربتومايسين في الماء ، وتعقيمها بالفلتر من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية. يتم تحضير الإريثروميسين في 95٪ إيثانول وتخزينه عند -20 درجة مئوية. أبلغت العديد من المختبرات عن الاستخدام الناجح للكانامايسين للاختيار بتركيز 200 ميكروغرام · مل −1 ؛ عند استخدام كل من الجنتاميسين والكانامايسين للاختيار في فحوصات التحويل ، يتم استخدام 400 ميكروغرام · مل −1 كاناميسين. يمنح جين aadA مقاومة لكل من الستربتومايسين والسبيكتينومايسين. لاختيار التركيبات التي تحتوي على جين aadA في E. يستخدم القولونيات ، 100 ميكروغرام · مل −1 سبيكتينومايسين. لاحظ أن الأمينوغليكوزيدات (كانامايسين ، جنتاميسين ، والستربتومايسين) ليست ذات صلة سريريا في علاج مرض لايم. ومع ذلك ، يستخدم الإريثروميسين سريريا في حالات معينة. على الرغم من المقاومة الطبيعية لهذا المضاد الحيوي في B. burgdorferi تم الإبلاغ عن علامة المقاومة هذه ، إلا أن علامة المقاومة هذه لم تستخدم حتى الآن في فحوصات التنبيغ المبلغ عنها هنا.
| مضاد حيوي | تركيز المخزون | التركيز النهائي في ثقافة Bb |
| كاناميسين | 100 mg.mL-1 (في الماء) | 200-400 ميكرومتر g.mL-1 |
| الجنتاميسين | 50 mg.mL-1 (في الماء) | 50 ميكرومتر g.mL-1 |
| الستربتومايسين | 50 mg.mL-1 (في الماء) | 50 ميكرومتر g.mL-1 |
| الاريثروميسين | 2 mg.mL-1 (في EtOH) | 0.06 ميكرو g.mL-1 |
الجدول 3: العوامل المحفزة المحتملة والتركيزات المستخدمة لتحريض φBB-1 من B. burgdorferi. N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) ، ميتومايسين C ، والإيثانول ، بالإضافة إلى الميثانول والأيزوبروبانول ، ثبت أنه يحفز φBB-1 فوق المستويات التأسيسية في سلالة B. burgdorferi CA.11-2A. MNNG هي مادة مسرطنة وخطر بيئي مشتبه بها. استخدمه بحذر ، وقم بإذابته في مذيب قابل للاحتراق ، وحرق للتخلص منه. الميتومايسين سي مادة مسرطنة مشتبه بها وخطر بيئي محتمل. استخدميه بحذر تحت غطاء الدخان الكيميائي وتخلصي منه بشكل صحيح. بينما تشير البيانات المنشورة إلى أن MNNG هو العامل الأكثر فعالية لتحفيز φBB-1 ، فإن مخاطر العمل مع هذه المادة الكيميائية والصعوبات في الحصول عليها تجعل استخدامها معقدا ، خاصة مع الطلاب. الحث بالإيثانول أفضل باستمرار من الميثانول أو الأيزوبروبانول وقد تم استخدامه بشكل شائع في مقايسة التنقيح.
| عامل محفز | تركيز المخزون (مذيب) | التركيز النهائي في العينة |
| ايثانول | 100٪ (لا يوجد) | 5% |
| ميتومايسين سي | 2 mg.mL-1 (ماء) | 20 ميكرومتر g.mL-1 |
| 1-ميثيل-3-نيتروسو-نيتروجوانيدين (MNNG) | 50 mg.mL-1 (DMSO) | 10 ميكرومتر g.mL-1 |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدات تصفية 1 لتر (PES ، حجم مسام 0.22 ميكرومتر) | ميليبور سيجما | S2GPU10RE | |
| أنبوب 12 مم × 75 مم (غطاء مزدوج الموضع) (بولي بروبلين) | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1450-0810 | يحمل 4 مل مع حجم فراغ منخفض (للتحريض) |
| أنابيب الطرد المركزي المخروطية سعة 15 مل (البولي بروبلين) | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 5618-8271 | |
| 1-ميثيل-3-نيتروسو-نيتروجوانيدين (MNNG) | ميليبور سيجما | تحذير: مادة مسرطنة محتملة; لم يعد متاحا بسهولة ، ولم يتم اختبار البديل المقدم | |
| ماصات باستور مقاس 5.75 بوصة (زجاج من القطن / البورسليكات / غير معقمة) | ثيرمو فيشر العلمي | 13-678-8 أ | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 50 مل (بولي بروبيلين) | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | 1500-1211 | |
| الإيثانول المطلق | |||
| باكتو نيوبيبتون | جيبكو | DF0119-17-9 | |
| باكتو TC الخميرة | جيبكو | 255772 | |
| ألبومين مصل البقر (درجة استبدال المصل) | الجوزاء المنتجات الحيوية | 700-104 بكسل | |
| CMRL-1066 بدون L-Glutamine (مسحوق) | الولايات المتحدة البيولوجية | ج 5900-01 | درجة زراعة الخلايا |
| الاريثروميسين | شركة منتجات البحوث الدولية | E57000-25.0 | |
| محلول كاشف الجنتاميسين | جيبكو | 15750-060 | |
| الجلوكوز (سكر العنب اللامائي) | ثيرمو فيشر العلمي | BP350-500 | |
| HEPES | ثيرمو فيشر العلمي | BP310-500 | |
| كبريتات الكاناميسين | ثيرمو فيشر العلمي | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) | ميليبور سيجما | SLGSM33SS | لتصفية المضادات الحيوية المعقمة وغيرها من المحاليل ذات الحجم الصغير |
| ميتومايسين سي | ثيرمو فيشر العلمي | BP25312 | تحذير: مادة مسرطنة محتملة; استخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي |
| ن-أسيتيل-د-جلوكوزامين | MP Biomedicals، LLC | 100068 | |
| طبق بتري (100 مم × 15 مم) | ثيرمو فيشر العلمي | FB0875712 | |
| مصل الأرانب غير المعقم المتأثر بالتحلل الدموي (NRS) | بيل فريز بيولوجيوس | 31119-3 | تعطيل الحرارة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة |
| بيكربونات الصوديوم | ثيرمو فيشر العلمي | BP328-500 | |
| بيروفات الصوديوم | ميليبور سيجما | P8674-25G | |
| محلول كبريتات الستربتومايسين | ميليبور سيجما | طراز S6501-50G | |
| سترات ثلاثي الصوديوم ثنائي الهيدرات | ميليبور سيجما | S1804-500G | سترات الصوديوم ل BSK |
