الكشف عن تحليل الهدف باستخدام جهاز استشعار حيوي بكتيري

الملخص

المصدر: Barber, A. E., et al. إعداد وتطبيق جهاز استشعار حيوي بكتيري جديد للكشف المفترض عن بقايا الطلقات النارية. J. Vis. خبرة. (2019).

يوضح هذا الفيديو اكتشاف تحليلات معينة باستخدام جهاز استشعار حيوي بكتيري. يتم أخذ مزرعة بكتيرية تحمل بلازميدا بجين بروتين فلوري أحمر (RFP) تحت محفز حساس للتحليل. بعد مسح سطح الاختبار جيدا ، يتم غمر جزء صغير من المناديل في الثقافة واحتضانه. ينشط تفاعل التحليل مع المروج تعبير RFP ، مما يؤكد وجود التحليل المستهدف.

البروتوكول

ملاحظة: يتم تقديم تخليق الإشريكية القولونية التي تعبر عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP).

1. تحضير حمض الديوكسي ريبونوكلييك البلازميد (DNA) من الإشريكية القولونية

1. قم بإذابة الإشريكية القولونية التي تحتوي على بلازميد مع جين RFP وجين مقاومة الأمبيسلين ، وقم بزراعة الإشريكية القولونية على ألواح أجار Luria Broth (LB) التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. على سبيل المثال ، استخدم بلازميد J10060 من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد). يشتمل بلازميد J10060 على جين RFP تحت سيطرة منطقة محفز pBad وجين مقاومة للأمبسيلين. بدلا من ذلك ، قم بتحويل الإشريكية القولونية (راجع الخطوة 3.2) باستخدام البلازميد قبل النمو على ألواح أجار LB.
2. اتبع بروتوكول miniprep القياسي (انظر جدول المواد) لعزل الحمض النووي من 1 مل من بكتريا قولونية التي تحتوي على بلازميد J10060. الغرض من البروتوكول التالي هو إزالة مروج pBad واستبداله بالمروج المطلوب للجهاز.
3. بعد miniprep البلازميد ، قم بتخزين الحمض النووي في الفريزر حتى يصبح جاهزا للهضم.

2. تقييد هضم إنزيم

1. قم بإعداد التفاعل التالي في أنبوب طرد مركزي دقيق لهضم EcoRI و NheI: 10 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد J10060 (معزول في الخطوة 1) ، و 8 ميكرولتر من الماء ، و 1 ميكرولتر من كل من إنزيمات EcoRI و NheI ممزوجة مسبقا مع 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت (انظر جدول المواد).
2. بالنسبة للحمض النووي للمحفز ، قم بإعداد التفاعل التالي في أنبوب الطرد المركزي الدقيق لهضم EcoRI و NheI: 10 ميكرولتر من تسلسل الحمض النووي المروج الملدن (8 ميكرولتر من الماء ، و 1 ميكرولتر من كل من إنزيمات EcoRI و NheI مختلطة مسبقا مع 1 ميكرولتر من المخزن العازل.
   1. بالنسبة للأنتيمون (Sb-) أو الرصاص (Pb-) أو ثلاثي نيتروتولوين (TNT) -RFP (انظر جدول المواد) ، قم بإذابة قليل النوكليوتيدات في المخزن المؤقت (30 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازين حمض إيثان سلفونيك (HEPES) ، درجة الحموضة 7.5 ؛ 100 ملي أسيتات البوتاسيوم) ، احتضان بتركيزات مولية متساوية ، تسخين إلى 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، وتبريد تدريجيا في درجة حرارة الغرفة).
3. امزج العينات عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل مع ضبط الماصة على 10 ميكرولتر.
4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. قم بتعطيل الإنزيمات بالحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
6. قم بتخزين الحمض النووي المهضوم في الفريزر حتى يصبح جاهزا للخطوة التالية.

3. الربط والتحول

1. الربط
   1. باستخدام البلازميد والحمض النووي المروج الذي تم هضمهما مرتين باستخدام EcoRI و NheI في الخطوة 2 ، قم بإعداد خليط التفاعل الموضح في الجدول 1 في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد ؛ أضف T4 DNA Ligase أخيرا. ملاحظة: يوضح الجدول 1 ربطا باستخدام نسبة مولية تبلغ 1: 3 متجه لإدخاله لأحجام الحمض النووي المشار إليها.
   2. امزج التفاعل برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل وجهاز الطرد المركزي الدقيق لفترة وجيزة.
   3. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
   4. يعطل الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
2. التحول
   1. قم بإذابة أنبوب يحتوي على 20 ميكرولتر من DH5-alpha بكفاءة بكتريا قولونية على الجليد حتى تختفي آخر بلورات الجليد.
   2. أضف 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد إلى خليط الخلية. قم بنقر الأنبوب بعناية 4-5 مرات لخلط الخلايا والحمض النووي.
   3. ضع الخليط على الثلج لمدة 2 دقيقة.
   4. صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية بالضبط لمدة 30 ثانية بالضبط. لا تخلط.
   5. ضعها على الثلج لمدة 2 دقيقة. لا تخلط.
   6. ماصة 380 ميكرولتر من مرق درجة حرارة الغرفة الأمثل للغاية مع قمع الكبابيليت (SOC) في الخليط. يوزع على الفور على صفيحة أجار LB تحتوي على الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
   7. افحص اللوحات في غضون 24 ساعة للنمو.
   8. أغلق الألواح بغشاء مانع للتسرب واحفظها في الثلاجة حتى تصبح جاهزة للخطوة التالية.

4. تفاعل بوليميراز المستعمرة المتسلسل (PCR)

1. أضف إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (قم بإعداد 4 أنابيب تفاعل) مخاليط التفاعل الموضحة في الجدول 2.
2. امزج ردود الفعل برفق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
3. باستخدام طرف ماصة صفراء ، اكشط مستعمرة (أو منطقة صغيرة جدا) من الإشريكية القولونية المحولة. انقل تمريرة من بكتريا قولونية إلى لوحة LB / ampicillin / agar جديدة تم تقسيمها ، ثم أدخل طرف الماصة في أنبوب PCR. رج طرف الماصة لخلط الإشريكية القولونية مع مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). كرر ثلاث مرات أخرى لمستعمرات إضافية. انقل أنابيب PCR إلى جهاز PCR وابدأ التدوير الحراري باستخدام البرنامج الموضح في الجدول 3.
4. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي للهلام باستخدام هلام الاغاروز بنسبة 2٪ في TAE 9Tris-Acetate-EDTA) لتحديد المستعمرات التي لديها أفضل ربط في البلازميد ، وتنمية تلك المستعمرات على طبق جديد.
5. قم بتخزين الأطباق في الثلاجة حتى تصبح جاهزة للاختبار. قم بإعداد مزرعة سائلة في مرق لوريا مع إضافة 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين للاختبار الكيميائي.

5. تسلسل الحمض النووي

1. لكل عينة ، أضف 5 ميكرولتر من البلازميد ، و 4 ميكرولتر من برايمر التسلسل ، و 3 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
2. ضع هذا الخليط في أنبوب وأرسله لتسلسل الحمض النووي (انظر جدول المواد).
3. تحليل بيانات تسلسل الحمض النووي لمقارنة تسلسل الحمض النووي المتوقع والملاحظ باستخدام برنامج تحليل تسلسل الحمض النووي للتأكد من عدم وجود طفرة وإدخال الجينات بشكل صحيح.
   ملاحظة: استخدام الإشريكية القولونية كجهاز استشعار كيميائي معروض أدناه.

6. تحضير ثقافات الإشريكية القولونية

1. تحضير LB مع 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين للمزارع السائلة.
2. قم بإعداد المزارع السائلة لبكتيريا المستشعر، وبكتيريا التحكم الإيجابي* وبكتيريا التحكم السلبي**.
   ملاحظة: * بكتيريا التحكم الإيجابية: بكتريا قولونية تحتوي على بلازميد مع جين RFP تحت سيطرة محفز تأسيسي ؛ البلازميد E1010 من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد) تم استخدامه في هذا العمل.** بكتيريا التحكم السلبية: بكتريا قولونية تحتوي على بلازميد مع جين RFP تحت سيطرة محفز مختلف ، مثل محفز pBad (البلازميد J10060 من سجل الأجزاء البيولوجية القياسية المستخدمة في البيولوجيا التركيبية (انظر جدول المواد) أو البلازميد الذي لا يحتوي على جين RFP.
3. ضع الثقافات في حاضنة اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة لمدة لا تقل عن 8 ساعات ، بحد أقصى 18 ساعة. يشير المرق الغائم إلى نمو البكتيريا.

7. معايرة الإشريكية القولونية للتحقق من وظيفة الجهاز

ملاحظة: بمجرد معايرة المستشعرات للتحقق من الوظيفة ، لا يلزم تكرار هذه الخطوة. يمكن للتحكم الإيجابي في شكل إضافة الرصاص والأنتيمون و 2،4-DNT أو 1،3-dinitrobenzene (1،3-DNB) التحقق من وظيفة الأجهزة لكل استخدام دون الحاجة إلى المعايرة بالتحليل الحجمي الكامل.

1. قم بإعداد محلول مخزون من المادة (المواد التحليلية) ذات الأهمية بتركيز 10 جزء في المليون في الماء. إذا كانت الذوبان مشكلة ، فاستخدم خليط 50/50 ماء / ميثانول.
2. باستخدام الجدول 4 كدليل ، قم بتسمية العدد المناسب من أنابيب الاستزراع المعقمة وضع 2 مل من المرق المستزرع (من خطوة البروتوكول 6) في كل أنبوب.
   ملاحظة: من أجل تحديد نطاق تحليلي عام ، قم بإجراء ثلاثة مستويات مختلفة على الأقل من المادة التحليلية باستخدام بكتيريا المستشعر ، ومستوى واحد مع التحكم السلبي ، ومستوى واحد مع التحكم الإيجابي. يجب أن يكون هناك أيضا أنبوب واحد لكل بكتيريا لا يحتوي على معدن مضاف (نوع آخر من التحكم السلبي). لتحديد النطاق التحليلي وحدود الكشف بشكل أكثر دقة ، استخدم نطاقا أكبر من تركيزات المادة التحليلية.
3. أضف محلول مخزون المادة التحليلية إلى الأنابيب التي تحتوي على 2 مل من المرق كما هو مذكور في الجدول 4 ، ضع أغطية المفاجئة على أنبوب الاستزراع بحيث تكون فضفاضة (للسماح بتدفق الهواء إلى الأنبوب) ، وقم بدوامة أنبوب الاستزراع.
4. اترك أغطية المفاجئة بشكل غير محكم على أنابيب الاستزراع ، وضعها في حاضنة اهتزاز عند 220 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
5. قم بإزالة الأنابيب من الحاضنة ، وقم بتثبيت الأغطية على الأنابيب بإحكام ، وقم بتخزين الأنابيب في الثلاجة حتى تصبح جاهزة لتحليل التألق.

8. استخدام الإشريكية القولونية كجهاز استشعار كيميائي لبقايا الطلقات النارية (GSR)

1. باستخدام منديل قائم على الإيثانول مصمم لإزالة الرصاص (انظر جدول المواد) ، امسح جميع أسطح اليدين ، بما في ذلك بين الأصابع. استخدم مسحة منفصلة لكل يد. قم بتخزين المناديل المبللة في كيس قابل للغلق مكتوب بشكل مناسب حتى التحليل.
2. لاختبار الأسطح ، استخدم مناديل مدديل كحولية للأسطح الكبيرة أو قطعة قطن مبللة بالإيثانول للأسطح الصغيرة.
   ملاحظة: لإثبات استجابة المستشعرات ل GSR ، تم مسح الجزء الداخلي من غلاف خرطوشة عيار 40 مستهلك بقطعة قطن مبللة بالإيثانول.
3. ارتداء قفازات نظيفة واستخدام مقص تم تنظيفه بالكحول ، قم بقص قسم حوالي 1 سم² من وسط المناحيل
4. ضع القطعة المقطوعة من منديل اليد أو مسحة القطن مباشرة في أنبوب مزرعة يحتوي على 2 مل من بكتيريا المستشعر ، مما يضمن غمرها في المرق.
5. تابع كما هو موضح أعلاه في الخطوات 7.4 - 7.5.

الجدول 1. خليط التفاعل للربط ، خطوة البروتوكول 3.1.1.

مكون	20 ميكرولتر رد فعل
10X T4 الحمض النووي Ligase العازلة	2 ميكرولتر
الحمض النووي البلازميد (3 كيلو بايت)	3 ميكرولتر
الحمض النووي المروج (0.7 كيلو بايت)	10 ميكرولتر
مياه خالية من النوكلياز	4 ميكرولتر
T4 DNA Ligase	1 ميكرولتر

 

 

 

 

 

 

الجدول 2. مخاليط التفاعل لتفاعل البوليميراز المتسلسل ، خطوة البروتوكول 4.1.

مكون	تفاعل 25 ميكرولتر
10 ميكرومتر التمهيدي الأمامي	0.5 ميكرولتر
10 ميكرومتر التمهيدي العكسي	0.5 ميكرولتر
ونتاق 2X ماستر ميكس	12.5 ميكرولتر
مياه خالية من النوكلياز	11 ميكرولتر

 

 

 

 

 

الجدول 3. معلمات التدوير الحراري PCR لخطوة البروتوكول 4.3.

درج	درجة الحرارة	الوقت
التمسخ الأولي	94 درجة مئوية	30 ثانية
30 دورة	94 درجة مئوية	30 ثانية
	55 درجة مئوية	45 ثانية
	68 درجة مئوية	60 ثانية
التمديد النهائي	68 درجة مئوية	5 دقائق
مسك	4 درجة مئوية

 

 

 

 

 

 

 

الجدول 4. إعداد تجربة عامة لمعايرة المستشعرات الحيوية ، خطوة البروتوكول 7.2.

معرف الأنبوب	بكتيريا	تركيز محلول المادة المراد إضافته (جزء في المليون)	تمت إضافة المعدن	تمت إضافة حجم محلول المادة المراد تحليله إلى 2,000 ميكرولتر من المرق	[تحليل] ، جزء بب
1	برنامج PbRFP	10	الرصاص	2.5	12
2	برنامج PbRFP	10	الرصاص	75	361
3	برنامج PbRFP	10	الرصاص	150	698
4	برنامج PbRFP	0	اي	0	0
5	RFP neg	10	الرصاص	10	50
6	طلب تقديم العروض	10	الرصاص	10	50

المواد