يوضح هذا الفيديو مقايسة حشد باستخدام البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر لمراقبة حركة السطح على الأجار الناعم. يلتقط التصوير بفاصل زمني التمدد المنسق وتكوين المحلاق ، مما يسلط الضوء على حركة السطح البكتيري.
إعداد وسائل الإعلام ملاحظه: التركيب المتوسط الموضح أدناه ينطبق على دراسات تكوين محلاق Pseudomonas aeruginosa . يرجى الاطلاع على مواصفات الوسائط في الجدول 1 لمقايسات حركة سطح Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis و Myxococcus xanthus .
امزج 200 مل من المفاعل الحيوي الهوائي المميع (FAB) - ناقص كبريتات الأمونيوم ((NH4) 2SO4) وسط السرب (جدول المواد) ، 0.9 جرام من أجار نوبل ، و 0.2 جرام من أحماض الكامينو (الجدول 1) عن طريق التحريك باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. استخدم كميات صغيرة (100-300 مل) لتحسين الاتساق بين التجارب.
قم بالأوتوكلاف على خليط الأجار / الوسائط سعة 200 مل باستخدام وقت تعريض ضوئي يبلغ 22 دقيقة ، ودرجة حرارة تعرض تبلغ 121.1 درجة مئوية ، وخيار تنفيس سريع. ستسمح إعدادات الأوتوكلاف بالتعقيم المناسب وذوبان الأجار ، ولكنها تمنع كراميل الأجار. ملاحظه: أجار النبيل عرضة للكراميل. يتم تغيير الحركة البكتيرية على أجار بالكراميل.
مباشرة بعد الانتهاء من دورة التعقيم ، أغلق غطاء زجاجة الوسائط لمنع فقدان الماء عن طريق التبخر. ومع ذلك ، لاحظ أن السد الضيق يمكن أن يسبب تأثيرا يشبه "الختم بالفراغ" على الزجاجة.
قم بتبريد الوسائط إلى 50 درجة مئوية مع التقليب في درجة حرارة الغرفة (RT) وأضف 2 مل من الجلوكوز المعقم 1.2 متر. بدلا من ذلك ، ضع الوسائط في حاضنة 60 درجة مئوية أو حمام مائي حتى تصبح جاهزة للاستخدام (حتى 15 ساعة لاحقا) ، وتابع كما هو موضح. لمنع تكوين الفقاعات في الوسائط ، امزجها جيدا باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي ؛ الفقاعات الموجودة على سطح الأجار ستمنع الاحتشاد. ملاحظه: بالنسبة للمقايسات الأخرى ، أضف المكونات الحساسة للحرارة التي لا يمكن تعقيمها ، مثل العناصر الغذائية أو الأصباغ الإضافية ، في هذه الخطوة ، حسب الحاجة (على سبيل المثال ، 8 ميكرولتر صبغة Invitrogen Syto 63 لكل 100 مل أجار مذاب لصورة M.xanthus ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية أدناه). قد تؤثر إضافة بعض الأصباغ على سلوك الاحتشاد الأساسي ، والذي يجب فحصه مقابل عنصر تحكم غير صبغي.
في غطاء المختبر ، قم بتخصيص 7.5 مل من الوسائط المعقمة لكل طبق بتري بوليسترين بقطر 60 مم والحفاظ على الألواح في طبقة واحدة (غير مكدسة). للحصول على سطح حشد أكبر ، قم بتخصيص 25 مل من الوسائط لكل طبق بتري بقطر 100 مم. من المهم ملء الأطباق على سطح أفقي متساو. استخدم مستوى عين الثور للتحقق مما إذا كان السطح مستويا. ملاحظه: بالنسبة لفحوصات المتصورة الزنجارية ، فإن استخدام حجم وسائط معين لكل لوحة سيحسن الاتساق والاستنساخ. بالنسبة لمقايسات B. subtilis و M. xanthus ، ينتج عن الصب اليدوي نتائج مماثلة لكميات محددة.
معالجة الألواح
بالنسبة للألواح الصغيرة (60 مم) ، اترك وسط الأجار المذاب للعلاج (كلاهما مضبوطا على سائل زائد شبه صلب وجاف) في غطاء المحرك مكشوفا (أي بدون أغطية) لمدة 30 دقيقة. تتطلب الألواح الأكبر حجما (100 مم) وقت معالجة أطول (انظر المناقشة). ملاحظه: بدلا من ذلك ، قد تتطلب بعض المقايسات معالجة ألواح على سطح المقعد طوال الليل (20-24 ساعة) مغطاة (أي الأغطية) في طبقة واحدة (الجدول 1). الاحتشاد حساس لكل من الرطوبة الزائدة وغير الكافية. قد تتطلب الرطوبة وتدفق الهواء ودرجة الحرارة في أي مختبر معين تباينا في معالجة الألواح لتعزيز الاحتشاد الأمثل للبكتيريا.
تلقيح الألواح مباشرة بعد انتهاء فترة التجفيف. لا تقم بتخزين اللوحات لاستخدامها مرة أخرى.
قم بإجراء "اختبار انتشار الحبر" عن طريق اكتشاف لوحة اختبار بمزيج 10 ميكرولتر من 0.50٪ (حجم / حجم) من حبر هيغينز الهندي الأسود المقاوم للماء واللقاح البكتيري. إذا انتشر خليط الحبر / اللقاح بسهولة (أي لا يحتفظ بشكل قطرات) على سطح الوسائط ، فستحتاج الوسائط إلى وقت إضافي حتى تجف. ملاحظه: بالنسبة للأنواع الحساسة بشكل خاص للرطوبة (على سبيل المثال ، P. aeruginosa) ، قم بإجراء "اختبار انتشار الحبر" السريع لتحديد ما إذا كانت الألواح جافة بدرجة كافية أم لا.
تلقيح فحص السرب
قم بتلقيح 6 مل من وسائط زراعة المرق (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل) بمستعمرة معزولة من مزرعة طبق مرق ليسوجيني (LB) طازجة (< 5 أيام إذا تركت في درجة حرارة الغرفة). احتضان مزارع المرق طوال الليل (≤18 ساعة) عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية مع الاهتزاز الأفقي (240 دورة في الدقيقة).
قم بتلقيح ألواح السرب عن طريق اكتشاف 1-5 ميكرولتر من ثقافة المرق طوال الليل ، أو عن طريق "وخز" الأجار باستخدام عود أسنان معقم أو إبرة تلقيح سلكية. ملاحظه: نحن نفضل الطريقة الأخيرة لأنها تقلل من احتمالية تناثر اللقاح وتمنع إضافة رطوبة إضافية إلى مساحة سطح السرب.
حضانة فحص السرب
لإجراء اختبار عام ، احتضان لوحات فحص السرب عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية (أو حتى 42 درجة مئوية ل B.subtilis; الجدول1) - هذا خاص بالبكتيريا. اقلب الألواح أثناء الحضانة بحيث تتكثف الرطوبة الزائدة على الغطاء ، وليس الأجار. ملاحظه: يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على النمط الظاهري والحركية. بالنسبة لأسراب المتصورة الزنجارية ، تؤدي الحضانة عند 37 درجة مئوية إلى نمو أسرع وتمدد السرب من الحضانة عند 30 درجة مئوية. ومع ذلك ، غالبا ما يختلف مورفولوجيا هذه الأسراب مع هذا التغير في درجة الحرارة.
للتصوير بفاصل زمني، احتضان ألواح السرب عند درجة الحرارة المناسبة قبل نقلها إلى محطة التصوير (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل). ملاحظه: تسمح حضانة التصوير المسبق هذه للأسراب ببدء تطورها وترسيخها قبل نقلها إلى بيئة جديدة ، والتي قد تكون أو لا تكون مثالية لحركة الاحتشاد.
2. التصوير العياني لمقايسات حركة السطح
للتصوير بفاصل زمني، بعد فترة حضانة ما قبل التصوير، ضع لوحات فحص السرب على لوحة تصوير شفافة داخل محطة تصوير تجارية في الجسم الحي . صورة يصل قطرها إلى ستة أو 60 مم أو أربعة لوحات قطرها 100 مم في المرة الواحدة. نظرا لأن الكاميرا تلتقط صورا من أسفل مستوى التصوير ، فقم بقلب اللوحات بحيث لا يتم إعاقة المسار البصري. بدلا من ذلك ، احتضان عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية (الجدول 1) طوال مدة التجربة ، وقم بإزالة اللوحات المراد تصويرها من الحاضنة على فترات زمنية محددة.
ضع أغطية أطباق بتري في وضع مستقيم فوق نظير اللوحة الذي يحمل الوسائط الملقحة. املأ أغطية أطباق بتري بالماء لمنع الجفاف المفرط أثناء التصوير ، وقم بإحاطة الإعداد بالكامل باستخدام صينية شفافة أخرى للحفاظ على الرطوبة طوال التجربة.
باستخدام برنامج التصوير الجزيئي (MI) ، قم بإجراء الفحص (المقايسات) في درجة حرارة الغرفة باستخدام إعدادات التصوير الموضحة في الجدول 2. للتصوير بفاصل زمني، قم بإعداد بروتوكول بالخطوات والمواصفات اللازمة.
الجدول 1: مواصفات إعداد فحص حركة السطح. يتضمن مواصفات تحضير مقايسة حركة السطح ل P. aeruginosa و B. subtilis و M. xanthus.