فحص الاحتشاد لتصور حركة سطح البكتيريا

الملخص

المصدر: موراليس سوتو ، ن. وآخرون ، التحضير والتصوير والقياس الكمي لمقايسات حركة السطح البكتيري. J. Vis. خبرة. (2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة حشد باستخدام البكتيريا التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر لمراقبة حركة السطح على الأجار الناعم. يلتقط التصوير بفاصل زمني التمدد المنسق وتكوين المحلاق ، مما يسلط الضوء على حركة السطح البكتيري.

البروتوكول

1. إعداد وسائط فحص السرب والتلقيح

1. إعداد وسائل الإعلام
   ملاحظه: التركيب المتوسط الموضح أدناه ينطبق على دراسات تكوين محلاق Pseudomonas aeruginosa . يرجى الاطلاع على مواصفات الوسائط في الجدول 1 لمقايسات حركة سطح Pseudomonas aeruginosa و Bacillus subtilis و Myxococcus xanthus .
   1. امزج 200 مل من المفاعل الحيوي الهوائي المميع (FAB) - ناقص كبريتات الأمونيوم ((NH4) ₂SO₄) وسط السرب (جدول المواد) ، 0.9 جرام من أجار نوبل ، و 0.2 جرام من أحماض الكامينو (الجدول 1) عن طريق التحريك باستخدام قضيب تحريك مغناطيسي. استخدم كميات صغيرة (100-300 مل) لتحسين الاتساق بين التجارب.
   2. قم بالأوتوكلاف على خليط الأجار / الوسائط سعة 200 مل باستخدام وقت تعريض ضوئي يبلغ 22 دقيقة ، ودرجة حرارة تعرض تبلغ 121.1 درجة مئوية ، وخيار تنفيس سريع. ستسمح إعدادات الأوتوكلاف بالتعقيم المناسب وذوبان الأجار ، ولكنها تمنع كراميل الأجار.
      ملاحظه: أجار النبيل عرضة للكراميل. يتم تغيير الحركة البكتيرية على أجار بالكراميل.
   3. مباشرة بعد الانتهاء من دورة التعقيم ، أغلق غطاء زجاجة الوسائط لمنع فقدان الماء عن طريق التبخر. ومع ذلك ، لاحظ أن السد الضيق يمكن أن يسبب تأثيرا يشبه "الختم بالفراغ" على الزجاجة.
   4. قم بتبريد الوسائط إلى 50 درجة مئوية مع التقليب في درجة حرارة الغرفة (RT) وأضف 2 مل من الجلوكوز المعقم 1.2 متر. بدلا من ذلك ، ضع الوسائط في حاضنة 60 درجة مئوية أو حمام مائي حتى تصبح جاهزة للاستخدام (حتى 15 ساعة لاحقا) ، وتابع كما هو موضح. لمنع تكوين الفقاعات في الوسائط ، امزجها جيدا باستخدام قضيب التحريك المغناطيسي ؛ الفقاعات الموجودة على سطح الأجار ستمنع الاحتشاد.
      ملاحظه: بالنسبة للمقايسات الأخرى ، أضف المكونات الحساسة للحرارة التي لا يمكن تعقيمها ، مثل العناصر الغذائية أو الأصباغ الإضافية ، في هذه الخطوة ، حسب الحاجة (على سبيل المثال ، 8 ميكرولتر صبغة Invitrogen Syto 63 لكل 100 مل أجار مذاب لصورة M. xanthus ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية أدناه). قد تؤثر إضافة بعض الأصباغ على سلوك الاحتشاد الأساسي ، والذي يجب فحصه مقابل عنصر تحكم غير صبغي.
   5. في غطاء المختبر ، قم بتخصيص 7.5 مل من الوسائط المعقمة لكل طبق بتري بوليسترين بقطر 60 مم والحفاظ على الألواح في طبقة واحدة (غير مكدسة). للحصول على سطح حشد أكبر ، قم بتخصيص 25 مل من الوسائط لكل طبق بتري بقطر 100 مم. من المهم ملء الأطباق على سطح أفقي متساو. استخدم مستوى عين الثور للتحقق مما إذا كان السطح مستويا.
      ملاحظه: بالنسبة لفحوصات المتصورة الزنجارية ، فإن استخدام حجم وسائط معين لكل لوحة سيحسن الاتساق والاستنساخ. بالنسبة لمقايسات B. subtilis و M. xanthus ، ينتج عن الصب اليدوي نتائج مماثلة لكميات محددة.
2. معالجة الألواح
   1. بالنسبة للألواح الصغيرة (60 مم) ، اترك وسط الأجار المذاب للعلاج (كلاهما مضبوطا على سائل زائد شبه صلب وجاف) في غطاء المحرك مكشوفا (أي بدون أغطية) لمدة 30 دقيقة. تتطلب الألواح الأكبر حجما (100 مم) وقت معالجة أطول (انظر المناقشة).
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، قد تتطلب بعض المقايسات معالجة ألواح على سطح المقعد طوال الليل (20-24 ساعة) مغطاة (أي الأغطية) في طبقة واحدة (الجدول 1). الاحتشاد حساس لكل من الرطوبة الزائدة وغير الكافية. قد تتطلب الرطوبة وتدفق الهواء ودرجة الحرارة في أي مختبر معين تباينا في معالجة الألواح لتعزيز الاحتشاد الأمثل للبكتيريا.
   2. تلقيح الألواح مباشرة بعد انتهاء فترة التجفيف. لا تقم بتخزين اللوحات لاستخدامها مرة أخرى.
      1. قم بإجراء "اختبار انتشار الحبر" عن طريق اكتشاف لوحة اختبار بمزيج 10 ميكرولتر من 0.50٪ (حجم / حجم) من حبر هيغينز الهندي الأسود المقاوم للماء واللقاح البكتيري. إذا انتشر خليط الحبر / اللقاح بسهولة (أي لا يحتفظ بشكل قطرات) على سطح الوسائط ، فستحتاج الوسائط إلى وقت إضافي حتى تجف.
         ملاحظه: بالنسبة للأنواع الحساسة بشكل خاص للرطوبة (على سبيل المثال ، P. aeruginosa) ، قم بإجراء "اختبار انتشار الحبر" السريع لتحديد ما إذا كانت الألواح جافة بدرجة كافية أم لا.
3. تلقيح فحص السرب
   1. قم بتلقيح 6 مل من وسائط زراعة المرق (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل) بمستعمرة معزولة من مزرعة طبق مرق ليسوجيني (LB) طازجة (< 5 أيام إذا تركت في درجة حرارة الغرفة). احتضان مزارع المرق طوال الليل (≤18 ساعة) عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية مع الاهتزاز الأفقي (240 دورة في الدقيقة).
   2. قم بتلقيح ألواح السرب عن طريق اكتشاف 1-5 ميكرولتر من ثقافة المرق طوال الليل ، أو عن طريق "وخز" الأجار باستخدام عود أسنان معقم أو إبرة تلقيح سلكية.
      ملاحظه: نحن نفضل الطريقة الأخيرة لأنها تقلل من احتمالية تناثر اللقاح وتمنع إضافة رطوبة إضافية إلى مساحة سطح السرب.
4. حضانة فحص السرب
   1. لإجراء اختبار عام ، احتضان لوحات فحص السرب عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية (أو حتى 42 درجة مئوية ل B. subtilis; الجدول 1) - هذا خاص بالبكتيريا. اقلب الألواح أثناء الحضانة بحيث تتكثف الرطوبة الزائدة على الغطاء ، وليس الأجار.
      ملاحظه: يمكن أن تؤثر درجة الحرارة على النمط الظاهري والحركية. بالنسبة لأسراب المتصورة الزنجارية ، تؤدي الحضانة عند 37 درجة مئوية إلى نمو أسرع وتمدد السرب من الحضانة عند 30 درجة مئوية. ومع ذلك ، غالبا ما يختلف مورفولوجيا هذه الأسراب مع هذا التغير في درجة الحرارة.
   2. للتصوير بفاصل زمني، احتضان ألواح السرب عند درجة الحرارة المناسبة قبل نقلها إلى محطة التصوير (انظر الجدول 1 للحصول على التفاصيل).
      ملاحظه: تسمح حضانة التصوير المسبق هذه للأسراب ببدء تطورها وترسيخها قبل نقلها إلى بيئة جديدة ، والتي قد تكون أو لا تكون مثالية لحركة الاحتشاد.

2. التصوير العياني لمقايسات حركة السطح

1. للتصوير بفاصل زمني، بعد فترة حضانة ما قبل التصوير، ضع لوحات فحص السرب على لوحة تصوير شفافة داخل محطة تصوير تجارية في الجسم الحي . صورة يصل قطرها إلى ستة أو 60 مم أو أربعة لوحات قطرها 100 مم في المرة الواحدة. نظرا لأن الكاميرا تلتقط صورا من أسفل مستوى التصوير ، فقم بقلب اللوحات بحيث لا يتم إعاقة المسار البصري. بدلا من ذلك ، احتضان عند 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية (الجدول 1) طوال مدة التجربة ، وقم بإزالة اللوحات المراد تصويرها من الحاضنة على فترات زمنية محددة.
2. ضع أغطية أطباق بتري في وضع مستقيم فوق نظير اللوحة الذي يحمل الوسائط الملقحة. املأ أغطية أطباق بتري بالماء لمنع الجفاف المفرط أثناء التصوير ، وقم بإحاطة الإعداد بالكامل باستخدام صينية شفافة أخرى للحفاظ على الرطوبة طوال التجربة.
3. باستخدام برنامج التصوير الجزيئي (MI) ، قم بإجراء الفحص (المقايسات) في درجة حرارة الغرفة باستخدام إعدادات التصوير الموضحة في الجدول 2. للتصوير بفاصل زمني، قم بإعداد بروتوكول بالخطوات والمواصفات اللازمة.

الجدول 1: مواصفات إعداد فحص حركة السطح. يتضمن مواصفات تحضير مقايسة حركة السطح ل P. aeruginosa و B. subtilis و M. xanthus.

	ف. الزنجارية	دراسات تكوين المحلاق المتصورة الزنجارية	ب. subtilis	م. زانثوس
وسائل الإعلام ثقافة المرق بين عشية وضحاها	فاب بلس 30 ملي جلوكوز	فاب بلس 30 ملي جلوكوز	رطل	CTT (الوسائط المعقدة)
درجة حرارة حضانة ثقافة المرق بين عشية وضحاها	37 درجة مئوية	37 درجة مئوية	37 درجة مئوية	30 ساعة عند 30 درجة مئوية
وسائط السرب	القوات المسلحه البورونديه	FAB ناقص (NH4) 2SO4	2٪ (بالوزن/الحجم) رطل	CTT
وسائط السرب: مكونات إضافية	12 ملي مولار جلوكوزأ	10٪ (بالوزن / الحجم) أحماض الكامينو (CAA) ، 12 ملي مولار جلوكوزأ	غير متاح	سيتو® 64أ
نوع أجار	أجار ، نوبل	أجار ، نوبل	أجار حبيبي	أجار ، نوبل أفيمتريكس
تركيز أجار (بالوزن / الحجم)	0.45%	0.45%	0.60%	1.50%
حجم لوحة السرب	60 ملم	60 ملم	100 مم	150 مم
حجم الوسائط لكل لوحة	7.5 مل	7.5 مل	يسكب يدويا	يسكب يدويا
طريقة إعداد / تجفيف وسائط السرب	غطاء محرك السيارة; لوحات مكشوفة	غطاء محرك السيارة; لوحات مكشوفة	لوحات منضدة مغطاة	لوحات منضدة مغطاة
إعداد وسائط السرب / وقت التجفيف	30 دقيقة	30 دقيقة	بين عشية وضحاها (20-24 ساعة)	بين عشية وضحاها (20-24 ساعة)
درجة حرارة حضانة فحص السرب	30 أو 37 درجة مئوية	30 درجة مئوية	37 درجة مئوية	30 درجة مئوية
حضانة للتصوير بفاصل زمني	30 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل	30 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل	37 درجة مئوية لمدة ساعتين	RT لمدة 12 ساعة
طول التقاط اللقطات المتتابعة	24 ساعة	24 ساعة	10 ساعات	66 ساعة
إعداد اللقطات المتتابعة	1 إطار/10 دقائق	1 إطار/10 دقائق	1 إطار/6 دقائق	1 إطار/10 دقائق
(أ) أضيفت بعد التعقيم

 

الجدول 2: مواصفات التصوير. مواصفات محطة تصوير بروكر للتصوير الفلوري باللونين الأحمر والأخضر واللمعان لنمو سطح البكتيريا.

إشارة	التألق الأخضر	التألق الأحمر الأول	التألق الأحمر II	التلالؤ
بروتين أو صبغة	بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)	بروتين mCherry أو صبغة رامنوليبيد أحمر النيل	سيتو® 64	لوسيفيراز من أوبرون لوكس
الطول الموجي للإثارة (نانومتر)	480 ± 10	540 ± 10	590 ± 10	قباله
الطول الموجي للانبعاث (نانومتر)	535 ± 17.5	600 ± 17.5	670 ± 17.5	لا يوجد مرشح
وقت التعرض (ثانية)	30	60	60	240
F-stop	4.0	4.0	2.5	1.1
مجال الرؤية (مم)	190	190	140	120
المستوى البؤري (مم)	27.5	27.5	12.2	4
التجميع (وحدات البكسل)	اي	2 × 2	اي	8 س 8

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
الكواشف:
الحد الأدنى من وسائط FAB:				استعد كل ~ 4 أسابيع. أعلى ما يصل إلى 1 لتر مع nanopure H2O.
(NH4)2إسو4	سيغما	أ 4418	2 جرام	لا تستخدم في دراسات تكوين المحلاق المتصورة الزنجارية .
Na2HPO4 × 7H2O	سيجما ألدريتش	طراز S9390	9 جرام
KH2PO4	سيغما	ص 5655	3 جرام
كلوريد الصوديوم	دينار بحريني	BDH8014	3 جرام
محلول MgCl2 × 6H2O (198 جم / لتر)	فيشر العلمية	إم 33	1 مل
محلول CaCl2 × 2H2O (14 جم / لتر)	فيشر العلمية	ج 79	1 مل
محلول معدني تتبع (انظر أدناه)	غير متاح	غير متاح	1 مل
محلول معدني أثر:				أعلى من 1 لتر مع nanopure H2O. يحفظ في زجاجة زجاجية مع التحريك ومغطى بورق الألمنيوم.
CaSO4 × 2H2O	سيجما ألدريتش	255548	200 مجم
MnSO4 × H2O	سيجما ألدريتش	م 7634	20 ملغ
CuSO4 × 5H2O	فيشر العلمية	ج 493	20 ملغ
ZnSO4 × 7 ساعات2O	سيجما ألدريتش	Z4750	20 ملغ
CoSO4 × 7 ساعات2O	سيجما ألدريتش	طراز C6768	10 مجم
NaMoO4 × 2 ساعة2س	سيغما	س6646	10 مجم
ح3بو3	فيشر العلمية	أ 74	5 مجم
FeSO4 × 7 ساعات2O	سيجما ألدريتش	إف 7002	200 مجم
وسائط CTT:				استعد حسب الحاجة. أعلى ما يصل إلى 100 مل مع nanopure H2O.
Tris-HCl ، محلول 1 م (ضبط على درجة الحموضة 8.0)	أمريسكو	234	1 مل	قم بإعداد محلول مخزون 1 متر في نانو نقي H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 وقم بتعقيم الفلتر (مسام 0.2 ميكرومتر).
حل K2HPO4 ، 1 M (ضبط على درجة الحموضة 7.6)	سيجما ألدريتش	ص 3786	0.1 مل	قم بإعداد محلول مخزون 1 متر في نانو نقي H2O. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.6 وقم بتعقيم الفلتر (0.2 ميكرومتر المسام).
محلول MgSO4	فيشر العلمية	إم 65	0.8 مل	قم بإعداد محلول مخزون 1 متر في نانو نقي H2O. تعقيم المرشح (0.2 ميكرومتر المسام).
كاسيتون	تشخيص BD	225930	1 جرام
الكواشف الإضافية:
مرق LB ، لينوكس	تشخيص BD	240230	2 ٪ (بالوزن/الحجم)
د- (+) - جلوكوز	سيجما ألدريتش	جي 5767	30 ملي لثقافات المرق بين عشية وضحاها; 12 ملي موتر لوسائط السرب	قم بإعداد محلول مخزون معقم بفلتر 1.2 متر في نانو نقي H2O. أضفه إلى الوسائط بعد التعقيم.
الأحماض الكاسامينو (CAA)	أمريسكو	J851	0.10 ٪ (بالوزن/الحجم)	موصى به لدراسات تكوين المحلاق المتصورة الزنجارية . أضف إلى الوسائط قبل التعقيم.
أجار ، نوبل	سيجما ألدريتش	أ 5431	0.45 ٪ (بالوزن/الحجم)	أجار نوبل مفضل لدراسات حركة سطح المتصورة الزنجارية . أضف إلى الوسائط قبل التعقيم.
أجار ، نوبل	أفيمتريكس	10907	1.50 ٪ (بالوزن/الحجم)	تستخدم في دراسات حركة سطح M. xanthus . لا ينصح بالدراسات الحركية المتصورة الزنجارية . أضف إلى الوسائط قبل التعقيم.
أجار ، محبب	فيشر العلمية	BP1423	0.60 ٪ (بالوزن/الحجم)
هيغينز حبر الهند الأسود المقاوم للماء	هيغنز	HIG44201	0.50 ٪ (الحجم/الحجم)	امزج الحبر مع اللقاح لاختبار رطوبة سطح الوسائط السربية.
SYTO® 64 صبغة حمض نووي فلورسنت أحمر	إنفيتروجين	إس-11346		استخدم 4 ميكرولتر ( ل P. aruginosa) أو 8 ميكرولتر (ل M. xanthus) من SYTO® 64 لكل 100 مل من الأجار المنصهر (يضاف بعد التعقيم).
المواد والمعدات ذات الصلة:
طبق بتري ، معقم ، 150 مم × 15 مم (Dia.x H)	VWR	25384-326
طبق بتري، معقم، 100 مم × 15 مم (Dia.x H)	VWR	25384-342
طبق بتري، معقم، 60 مم × 15 مم (Dia.x H)	VWR	25384-092
في الجسم الحي إكستريم	بروكر			استخدم للتصوير العياني لدراسات حركة السطح. http://www.bruker.com/products/preclinical-imaging/opticalx-ray-imaging/in-vivo-xtreme/overview.html