الفحص المجهري لتباين الطور لتقييم الطفرات التنموية في Streptomyces

Abstract

المصدر: بينيت ، ج. أ. وآخرون. التقييم البصري والمجهري للطفرات التنموية Streptomyces . J. Vis. خبرة. (2018)

يوضح هذا الفيديو استخدام الفحص المجهري لتباين الطور لفحص الاختلافات المظهرية بين النوع البري والطافور Streptomyces coelicolor. يحدد الخطوات المتبعة في إعداد وتصوير الخيوط الهوائية للكشف عن عيوب النمو في تكوين الأبواغ.

Protocol

1. إجراء الفحص المجهري التباين الطور

1. قم بتعقيم الملقط عن طريق غسله بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم المرور عبر لهب موقد بنسن لتبخر الإيثانول. تركه يبرد.
2. تعقيم الأغطيةزلات عن طريق غسلها بنسبة 70٪ من الإيثانول ثم السماح لها بالجفاف في طبق بتري معقم.
3. قم بإعداد رفع غطاء للنمو البكتيري ليتم فحصه.
   1. التقط غطاء معقم بملاقط معقمة وضع الغطاء على صفيحة أجار مانيتول من دقيق الصويا (MS) حيث يكون نمو بكتيريا Streptomyces coelicolor كثيفا. اضغط على الجزء الخلفي من الغطاء برفق باستخدام الملقط لضمان نقل كاف للجراثيم البكتيرية والفطريات الهوائية.
4. التقط الغطاء من اللوحة وضعه بحيث يكون الجانب الذي يحتوي على مادة الخلية متجها نحو سطح شريحة المجهر ، مع قطرة 15 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 50٪ محضرة في الماء للتركيب. قلل فقاعات الهواء عن طريق وضع الغطاء بزاوية 45 درجة على الشريحة وتركه يسقط على الجلسرين بنسبة 50٪.
5. (اختياري) ختم بطلاء أظافر شفاف للحفاظ على الشريحة.
6. قم بإجراء الفحص المجهري لتباين الطور على فترات زمنية مختلفة خلال دورات الحياة.
   ملاحظه: يسمح التصوير المتكرر بتحليل أكثر اكتمالا والقدرة على اكتشاف التأخير في النمو. كرر الملاحظات بشكل مستقل لضمان الدقة والتكرار.
   1. ضع الشريحة المحضرة على مرحلة المجهر وأضف قطرة من زيت الغمر إلى وسط الغطاء. قم بتدوير هدف المرحلة 100X في مكانه واضبط برج المكثف على إعداد المرحلة "المطابقة" المناسبة. ركز الصورة باستخدام مقبض الضبط الدقيق فقط بمجرد ملامسة العدسة الشيئية للزيت.
   2. افحص العديد من مجالات الرؤية لتمييز الاختلافات الملحوظة والمتسقة بين السلالات الطافرة والنوع البري ، مثل القدرة على تكوين الجراثيم ، وحجم وشكل الأبواغ ، والعدد الإجمالي للجراثيم (انظر الشكل 1).
      ملاحظه: تشمل بدائل الفحص المجهري لتباين الطور الفحص المجهري لتباين التداخل التفاضلي (DIC) وتقنيات التلوين البسيطة للاستخدام مع مجاهر المجال الساطع ، مثل تلطيخ البنفسج الكريستالي.

Results

الشكل 1: صور مجهرية تباين الطور تظهر خيوطا جوية تمثيلية ل Streptomyces سلالات الطفرة البيضاء Coelicolor التي تحتوي على طفرات عشوائية في إدخال الينقولات. (أ) يظهر خيوط هوائية تمثيلية من ا...

Materials