إنشاء مزرعة ثنائية للبكتيريا السكرية مع البكتيريا المضيفة

الملخص

المصدر: كولينز ، إيه جيه ، وآخرون ، إنشاء ثقافات ثنائية مستقرة للبكتيريا السكرية التكافلية من تجويف الفم. J . Vis. خبرة. (2021)

يوضح هذا الفيديو إنشاء وصيانة مزرعة ثنائية للبكتيريا السكرية والبكتيريا المضيفة لها عن طريق احتضانها بشكل تسلسلي في وسط نمو خاص بالمضيف.

البروتوكول

1. تركيز خلايا البكتيريا السكرية عن طريق الطرد المركزي
   1. ضع علامة اتجاه على الأنبوب والغطاء ، وضع الأنبوب في جهاز طرد مركزي عالي السرعة مع وضع العلامة على الجانب العلوي. عادة ما تكون الحبيبات المتكونة من الطرد المركزي غير مرئية. ستساعد الوسم في تحديد مكان وجود حبيبات خلايا البكتيريا السكرية عند إجراء الطرد المركزي وإزالة الأنبوب من جهاز الطرد المركزي.
   2. قم بالطرد المركزي للعينات عند 60,000 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظه: هذه القوة والوقت كافيان لبيل جميع خلايا البكتيريا السكرية. ومع ذلك ، يمكن تكوير خلايا البكتيريا السكرية جزئيا على الأقل عن طريق الطرد المركزي لمدة لا تقل عن 20 دقيقة عند 20,000 × جم.
   3. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي. اسكب السائل من الأنبوب ، مع الحفاظ على الحبيبات على الجانب العلوي من الأنبوب.
   4. أعد تعليق الحبيبات غير المرئية عادة في 1-2 مل من المخزن المؤقت MRD (مخفف الاسترداد الأقصى) عن طريق دوامة قوية.

2. إصابة المزارع المضيفة بالمرشح المخصب بالبكتيريا السكرية

1. قم بإعداد أنابيب الاستزراع عن طريق تخصيص 2 مل من وسائط النمو المناسبة (على سبيل المثال ، TSBY (مرق الصويا التربتيكي مع مستخلص الخميرة بنسبة 0.1٪) ، BHI (ضخ قلب الدماغ) ، إلخ) في الأنابيب.
2. أضف 200 ميكرولتر من الثقافة الليلية للكائنات المضيفة إلى كل أنبوب. أضف 100-200 ميكرولتر من العينة المعلقة والمفلترة إلى كل أنبوب.
3. احتضان عينات مجمعة حسب الاقتضاء للكائن الحي المضيف (على سبيل المثال ، 37 درجة مئوية ، في جو هوائي ل Arachnia propionica).
4. قم بتمرير الخلايا كل يومين إلى ثلاثة أيام عن طريق نقل 200 ميكرولتر من الثقافة الثنائية إلى 2 مل من وسط النمو الطازج في أنبوب جديد. إذا بدا أن الثقافات التي تم تمريرها لا تظهر أي نمو (أي أن التعكر / الكثافة البصرية للثقافة لا تزداد بعد المرور إلى الوسائط الجديدة) ، فقد تكون البكتيريا السكرية ساحقة أو تقتل جميع الكائنات الحية المضيفة. لعلاج ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من مزرعة المضيف غير المصابة عند مرور الخلايا. كرر لمدة 5 مقاطع على الأقل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مرق تسريب القلب في الدماغ (مسحوق مجفف)	بيكتون ديكنسون	211059	أو غيرها من وسائط النمو المناسبة للكائنات المستهدفة
جهاز الطرد المركزي الدوار 70-Ti	بيكمان كولتر	337922
2 صندوق قفازات التحكم في المختبر	مصانع الخجل	31615	إذا لزم الأمر للكائنات الهوائية الدقيقة
جهاز طرد مركزي عالي السرعة Optima L-100 XP	بيكمان كولتر	8043-30-1124
ماصة صغيرة P-1000	جيلسون	F123601G
ماصة صغيرة P-200	جيلسون	F123602G
PBS (محلول ملحي مخزن الفوسفات)	فيشر العلمية	BP399500
الببتون	فيشر العلمية	BP1420-500
أطراف الماصة - 1000 ميكرولتر	فيشر العلمية	02-717-166
أطراف ماصة - 200 ميكرولتر	فيشر العلمية	02-717-165
أنابيب الطرد المركزي المخروطية ذات الغطاء اللولبي 15 مل	صقر	352096	أو أنبوب آخر مناسب للثقافة البكتيرية
أنابيب طرد مركزي من البولي كربونات 25 × 89 مم (سعة 26.3 مل) مع أغطية	بيكمان كولتر	355618
لوحات أجار دم الصويا التربتيكية	خدمات مختبرات الشمال الشرقي	ص 1100	أو صفيحة أجار أخرى كافية لنمو الكائنات المضيفة
مرق الصويا التربتيكي (مسحوق مجفف)	بيكتون ديكنسون	211825	أو غيرها من وسائط النمو المناسبة للكائنات المستهدفة
مستخلص الخميرة	فيشر العلمية	BP1422-500